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副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是定植于健康猪上呼吸道的革兰氏阴性菌,当猪的免疫力下降或处于应激状态时可引起多发性纤维素性浆膜炎、关节炎、脑膜炎等典型病理变化,此病现已成为危害全球养猪业的主要疾病之一。目前,有许多文献报道HPS弱毒株能够引起副猪嗜血杆菌病,可能与弱毒株的毒力增强有关。为了分析强毒和弱毒HPS菌株毒力的差异及变化,本研究采用辽宁地区分离到的HPS弱毒株7型和9型及强毒株5型和13型进行细胞毒性分析,为揭示HPS不同血清型菌株的致病力提供科学的依据,同时也为防控副猪嗜血杆菌病及保障我国养猪业的健康发展提供参考。试验一、四株不同毒力HPS菌株对PK-15细胞损伤作用的研究。利用四株HPS攻毒PK-15细胞,通过细胞的病变观察、MTT及LDH相对释放量试验检测细胞的生存能力,同时检测对细胞的粘附和侵袭能力的影响,初步确定这四株HPS毒力的强弱。结果显示:(1)从细胞形态学来看,HPS攻毒12h后,5型和13型攻毒组的PK-15细胞形态不均匀、部分细胞边缘不清、贴壁细胞减少、细胞原有结构消失,而7型和9型细胞损伤程度较轻,但也可出现部分病变;透射电镜观察4株HPS对PK-15细胞的微观结构均能造成一定损伤,其中5型和13型HPS的损伤能力强于7型和9型HPS。(2)MTT检测四株HPS血清型攻毒HPS后,PK-15细胞存活率均有所下降(P<0.05或P<0.01),其中9型HPS攻毒后细胞存活率显著高于5型和13型HPS(P<0.05),两个强毒株与7型HPS攻毒组差异不显著(P>0.05);7型与两个强毒株组比有所升高(P>0.05)。(3)与7型和9型HPS攻毒组比较,13型HPS攻毒组细胞LDH相对释放量极显著增加(P<0.01),5型HPS攻毒组LDH相对释放量显著增加(P<0.05),说明强毒株对细胞膜的损伤程度更大。(4)5型HPS的粘附能力极显著强于7型、9型和13型HPS(P<0.01);7型HPS的侵入能力极显著强于5型、9型和13型HPS(P<0.01),推测这可能是临床7型HPS菌株致病力增强的原因之一。从整体分析,5型和13型HPS的毒力还是要强于7型和9型。试验二、四株不同毒力HPS诱导PK-15细胞的凋亡作用及机理研究采用Annexin V/PI双染、蛋白免疫印迹及荧光定量PCR试验对攻毒12h后的PK-15细胞凋亡情况进行研究。结果显示:(1)流式细胞术检测细胞凋亡发现5型和13型HPS强毒株能够诱导PK-15细胞发生凋亡(P<0.01),7型和9型HPS诱导细胞发生凋亡的能力较弱(P>0.05)。(2)5型和13型HPS攻毒组抑凋亡BCL-2蛋白相对表达量显著下降(P<0.05),促凋亡BAX蛋白相对表达量显著升高(P<0.05),说明两个强毒株可以通过BCL-2/Bax线粒体凋亡途径来促进细胞的凋亡。(3)5型和13型HPS攻毒组BCL-2 m RNA相对表达量显著降低(P<0.05),BAX m RNA相对表达量极显著升高(P<0.01),而7型和9型与空白和强毒侏组均未呈现显著性差异,说明两种强毒株HPS的致凋亡作用是通过上调BAX m RNA和下调BCL-2 m RNA的相对表达量来实现的。