论文部分内容阅读
5-羟色胺（5-HT）能系统作为神经内分泌系统的重要组成部分,在脊椎动物和无脊椎动物的许多生理过程中发挥着重要作用。它不仅调节机体的免疫应答、能量代谢、情绪调控、生长繁殖等过程,还参与了机体在环境压力下的应激反应。当压力来临时,机体的5-HT神经内分泌系统被激活并释放5-HT,5-HT与膜上的5-HT受体（5-HTR）结合后共同发挥调控作用。目前软体动物5-HT神经内分泌系统的组成特征,及其在应对环境胁迫时所发挥作用的相关报道还十分有限。本研究以长牡蛎为研究对象,利用免疫学、分子生物学和细胞生物学等手段,查明了软体动物5-HT神经内分泌系统的分子组成及表达特征,明确了5-HT神经内分泌系统对干露胁迫的响应模式,初步阐明了其在长牡蛎应对干露胁迫时发挥的调控作用。从长牡蛎中克隆获得了4个5-羟色胺受体基因:Cg5-HTR1、Cg5-HTR2、Cg5-HTR3和Cg5-HTR4,均为含有7次跨膜结构域的G蛋白偶联受体。Cg5-HTR1的cDNA全长为1443 bp,编码一条由480个氨基酸组成的多肽链;Cg5-HTR2的cDNA全长为1239 bp,编码一条由412个氨基酸组成的多肽链;Cg5-HTR3的cDNA全长为1254 bp,编码一条由417个氨基酸组成的多肽链;Cg5-HTR4的cDNA全长为1008 bp,编码一条由335个氨基酸组成的多肽链。4个Cg5-HTR的mRNA转录本均在肝胰腺、血细胞及性腺中呈组成型表达,其中肝胰腺表达量最高。Cg5-HTR1的mRNA转录本在外套膜中也有分布;Cg5-HTR2的mRNA转录本在闭壳肌中有分布;Cg5-HTR3和Cg5-HTR4的mRNA转录本分布较广,在鳃、闭壳肌、外套膜中均有分布。同时,5-HT主要分布于长牡蛎外套膜边缘、肝小管间隙以及脏神经节,在鳃、唇瓣和性腺中也有少量零星分布,但未在闭壳肌中检测其存在。此外,在5-HT刺激下,经Cg5-HTR3重组质粒转染后的Hela细胞内的二级信使Ca2+的水平显著提高,而用5-HTR抑制剂Way-10063或Metagoline提前孵育转染质粒的Hela细胞,其细胞内Ca2+水平未发生显著变化。干露胁迫后长牡蛎血清中5-HT含量呈现显著上升趋势,在胁迫后期上升幅度尤为显著。长牡蛎外套膜中5-HT表达水平在干露胁迫后同样呈现显著升高趋势。干露胁迫能够显著影响长牡蛎血细胞中Cg5-HTR的mRNA表达水平,其中Cg5-HTR1和Cg5-HTR3的表达量在胁迫后期显著升高,Cg5-HTR2的表达量在胁迫前期显著增加,而Cg5-HTR4表达量呈现先上升后下降的趋势,在胁迫后期恢复初始水平。外源添加5-HT能够显著抑制长牡蛎血细胞的凋亡,并显著提高血清中一氧化氮合酶（NOS）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性。持续的干露胁迫能够提高长牡蛎血细胞的凋亡率、血清中SOD的活性和过氧化氢（H2O2）的含量,并抑制血清中NOS的活性和血细胞中CgTNF的mRNA表达水平。在干露胁迫过程中注射5-HT后,长牡蛎血清中SOD的活性显著升高,而H2O2的含量显著降低;在胁迫应答前期血清中NOS的活性显著上升,在胁迫应答后期血细胞的凋亡率显著下降,个体存活率显著提高。上述结果表明,长牡蛎体内存在相对完善的5-HT神经内分泌系统,且5-HT和Cg5-HTR在各组织中广泛表达。干露胁迫下,5-HT神经内分泌系统被激活,5-HT在血清和外套膜中的含量显著升高,Cg5-HTR的mRNA转录本在血细胞中的表达也发生显著变化。激活的5-HT主要通过抑制细胞凋亡和增强抗氧化作用等机制来调控机体在干露胁迫下的应激反应,从而显著降低干露胁迫下长牡蛎的死亡率。