论文部分内容阅读
目的：肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis, RIF）是所有慢性肾脏病的共同结果，同时也是造成肾功能不可逆性损害的原因之一，延缓甚至逆转肾间质纤维化对于延缓慢性肾脏病的进展、延长患者寿命意义重大。肾损伤分子（kidney injury molecule1, KIM-1）是一种新型的Ⅰ型跨膜糖蛋白，在正常大鼠肾组织仅有极微量的表达，而在多种急性肾损伤模型中，如缺血再灌注损伤、中毒性肾损伤、造影剂肾病等中表达明显增加，且随肾脏结构和功能的修复其表达消退，因其在急性肾损伤诊断中灵敏性和特异性较高，目前成为一种较好的急性肾损伤的生物学标记物。同时也有研究发现KIM-1在慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD）时也有表达，已在蛋白超负荷肾病模型、阿霉素肾病、血管紧张素Ⅱ诱导纯合子Ren2大鼠肾损伤及多囊肾模型中得到证实，然而在CKD中KIM-1表达的具体分子机制及病理生理学意义尚不清楚。国内有学者分别观察了KIM-1和缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor1alpha, HIF-1α）在造影剂肾病大鼠模型和人近端肾小管上皮细胞（HK2）缺氧复氧过程中的表达情况及相互关系，结果均提示二者之间可能存在一定联系，KIM-1可能作为HIF-1α的下游靶点参与肾脏损伤和修复过程。本课题拟通过建立单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction, UUO）大鼠肾间质纤维化模型，观察肾组织的病理改变，结合免疫组织化学、PCR等检测手段，观察KIM-1、HIF-1α及α-SMA在肾间质纤维化大鼠肾组织中的表达变化以及应用HIF-1α抑制剂雷帕霉素后对其表达的影响，并进一步探讨KIM-1与HIF-1α、α-SMA的相互关系以及雷帕霉素对UUO大鼠的肾脏保护作用，为临床防治慢性肾脏病的进展提供实验性理论依据。方法：健康清洁级雄性SD大鼠72只，体重200±20g，随机分为假手术组（Sham组），模型组（UUO组），治疗组（Rap组），每组24只。UUO组和Rap组行左侧输尿管结扎并剪断，建立UUO模型；Sham组仅游离左侧输尿管，但不结扎和剪断。各组于手术前1天开始给药，根据体重调整药量，Rap组以雷帕霉素2mg/kg/d灌胃，Sham组与UUO组以等容积生理盐水灌胃，直至术后第14天。各组分别于术后1、4、7、14天随机处死6只大鼠，取左侧肾组织，一部分置于4%多聚甲醛中，用于HE染色观察病理改变，免疫组化染色法检测KIM-1、HIF-1α及α-SMA蛋白的表达，另一部分置于液氮中快速冷冻，随后转至-80℃冰箱中保存，用于RT-PCR法检测各因子的mRNA水平，然后分别采用图像分析系统和凝胶成像系统进行半定量分析。应用SPSS13.0统计分析软件对实验数据进行统计学处理，P<0.05为有统计学意义。结果：1实验大鼠肾组织形态学变化Sham组大鼠两侧肾脏大小相当，外观无明显差别；UUO组和Rap组梗阻侧肾脏体积大于对侧，且随梗阻时间的延长体积逐渐增大，可见肾实质较对侧明显变薄，颜色变浅，肾盂肾盏扩张变形，肾内积水，尤以术后14天最为显著。光镜下观察发现Sham组肾小球和肾小管结构均未见明显异常，UUO组和Rap组术后1天肾组织病理改变不明显，从术后4天病变较明显，开始出现肾小管扩张，肾小管上皮细胞刷状缘脱落，炎症细胞浸润，肾间质水肿，且随着梗阻时间延长，病变逐渐加重。与UUO组相比，Rap组大鼠肾组织病理学变化较轻。2免疫组织化学结果KIM-1在Sham组各个时间点均无明显表达，在UUO组于术后1天表达即开始增加，主要表达于近端肾小管上皮细胞，且随着时间推移表达明显升高，各时间点比较差异有统计学意义（P<0.05）；与同期UUO组相比，Rap组KIM-1表达均降低（P<0.05）。HIF-1α在Sham组肾小管上皮细胞偶见表达，肾小球内无阳性表达，各时间点比较差异无统计学意义（P<0.05）；与同期Sham组相比，UUO组术后1天表达开始增加，且随着时间推移，表达呈上升趋势，14天时表达最强，各时间点比较差异有统计学意义（P<0.05）；与同期UUO组相比，Rap组HIF-1α表达均受到明显抑制（P<0.05）。α-SMA在Sham组肾间质内未见明显表达，仅在肾小动脉高表达，UUO组术后1天表达开始增加，且随着时间推移，表达明显增高，除血管壁平滑肌细胞表达外，肾间质和部分肾小管上皮细胞周围均有表达，各时间点比较差异有统计学意义（P<0.05）；与同期UUO组相比，Rap组α-SMA表达均降低（P<0.05）。3RT-PCR结果与同期Sham组相比，术后1、4、7、14天UUO组大鼠肾组织中KIM-1mRNA、HIF-1α mRNA、α-SMA mRNA表达均增加（P<0.05），而给予雷帕霉素干预后，与同时期UUO组相比，Rap组大鼠肾组织中KIM-1mRNA、HIF-1α mRNA、α-SMA mRNA表达均有所下降（P<0.05），但较Sham组表达明显增高（P<0.05）。4相关性分析对KIM-1mRNA表达水平与HIF-1α、α-SMAmRNA的表达情况进行Pearson相关分析，结果表明：KIM-1mRNA与HIF-1α mRNA的表达水平呈正相关（r=0.874, P<0.05）；KIM-1mRNA与α-SMA mRNA的表达水平亦呈正相关（r=0.886, P<0.05）。结论：在单侧输尿管梗阻大鼠肾组织中，HIF-1α、KIM-1和α-SMA表达均升高；使用雷帕霉素干预后， HIF-1α、KIM-1和α-SMA的表达下调，肾间质纤维化程度减轻；KIM-1可能作为HIF-1α的下游分子参与了肾间质纤维化的发生发展。