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2010年冬季以来,由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)在全国范围内爆发,对哺乳仔猪具有很高的致死率,造成哺乳仔猪腹泻、呕吐、脱水、最后衰竭而死,给养猪业带来巨大经济损失。本研究希望从PEDV分子变异情况、血清学流行情况及生长特性等方面来解析河南省PEDV流行状况和病原学特征,为PEDV的综合防控提供依据。1.为了解河南地区PEDV M基因和ORF3基因遗传变异情况,对2012~2015年河南省不同猪场的16份PEDV阳性样品的M基因和ORF3基因进行克隆测序,分析其分子序列。结果如下:16个流行毒株的M基因不存在核苷酸和氨基酸的缺失和插入;16个流行毒株的M基因编码的氨基酸同源性为96.9%~99.6%,与CV777经典毒株、韩国毒株及2010年以后国内流行的大多数毒株的氨基酸同源性分别为97.4%~99.1%、96.9%~99.6%和97.8%~99.6%;与CV777经典毒株相比,除CHHe N ZZ-2012(ZZ)毒株外的15株流行毒株在第13个氨基酸位点发生了突变(E-Q/L)。16个流行毒株中CHHeN DF2-2012(DF2)和CHHeN DF2-2012(ZZ)毒株的ORF3基因存在49个核苷酸缺失,与CV777疫苗株核苷酸同源性为100%;与CV777经典毒株相比,2株缺失毒株存在13个核苷酸位点和5个氨基酸位点的一致突变。其余14个流行毒株相互间氨基酸同源性为98.1%~100%,与CV777经典毒株、CV777疫苗株和韩国毒株氨基酸同源性分别为95.1%%~96.0%、90.2%%~91.1%和97.3%~99.1%,与2010年以后国内流行的大多数毒株氨基酸同源性为97.3%~99.6%;与CV777经典毒株相比,14个流行毒株的核苷酸和氨基酸一致突变位点分别为19个和8个。进化树分析显示,M基因可分为4个群,河南PEDV流行毒株主要以基因3群为主,其中ZZ毒株属于基因2群;ORF3基因分为3个群,DF2毒株和ZZ毒株分布于基因2群,其余14个毒株属于基因3群。表明当前河南主要流行的PEDV毒株的M基因和ORF3基因与2010年以后国内流行的大多数毒株同源性较高,与韩国毒株亲缘关系较近;与经典毒株和疫苗株相比,其M基因和ORF3基因发生了变异。2.将原核表达纯化后的PEDV N蛋白作为包被抗原,建立了PEDV间接ELSIA方法,并利用该方法对河南省200份临床血清进行检测。经组分及条件优化,确定包被抗原浓度为0.5μg/mL,0.5%Casein 4℃封闭过夜,血清最佳稀ii释倍数为1:100,37℃作用60min,二抗浓度为1:20000,37℃作用60min,血清临界值s/p≥0.262,判为阳性,s/p<0.247判为阴性,介于两者之间判为可疑。该方法对猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬及猪口蹄疫阳性血清检测结果均为阴性。批内、批间重复试验变异系数在2.22%~4.21%和3.06%~10.81%。与商品化试剂盒相比,相对灵敏性和相对特异性及二者符合率分别为95.00%、97.22%和95.83%。200份临床血清进行检测,结果显示pedv的阳性率为66.00%,其中,发病猪场阳性率为70.00%,免疫猪场阳性率为85.00%,未免猪场阳性率为15.00%;母猪抗体阳性率为68.30%,仔猪和育肥猪抗体阳性率分别为33.33%和56.7%。本研究建立的间接elisa方法具有较好的特异性、灵敏性和重复性,可用于pedv抗体检测及流行病学调查;对200份河南省pedv血清检测结果显示河南省pedv抗体阳性率较高,但仔猪抗体阳性率较低,需加强防护和综合防控。3、为研究pedv的分离培养特性,本研究将鉴定为pedv阳性的仔猪肠内容物处理之后,接种于vero细胞上,在不含血清的病毒维持液中加入终浓度为10μg/ml的胰酶,进行传代培养。对细胞培养物进行rt-pcr、细胞免疫荧光(ifa)鉴定和基因序列测定;对pedv分离株的细胞培养,增值规律及稳定传代等培养特性进行研究;采用固定病毒-稀释血清的方法,对不同临床背景血清进行抗体中和试验。结果显示:将病毒接种vero细胞盲传至第7代,出现cpe病变,随着代次增加,cpe出现时间变短,呈现规律性变化,rt-pcr鉴定为阳性,ifa检测可见特异性荧光,s1、m、orf3基因测序结果为pedv对应基因片段,确认分离到一株pedv(chhen-zz)。通过fq-pcr,绘制胞内、胞外病毒一步生长曲线,胞内病毒含量0h~12h逐步上升,12h达到峰值,之后逐渐下降,48h下降幅度突然增大;胞外病毒24h~72h出现快速增加,72h左右达到峰值,之后开始逐步下降。pedv从第20代到第50代,tcid50稳定在10-5.5~10-6.2/0.1ml之间,现已传至50代,tcid50值为10-6.11/0.1ml;对不同代次分离毒株的m基因和s1基因进行序列分析,第7代与第50代之间的核苷酸同源性分别为99.6%~99.9%、99.8%~99.9%;分离毒株s1基因与cv777疫苗株同属于基因i群,利用分离毒株进行抗体中和试验显示:临床上未曾免疫但感染过基因iii群pedv的猪场血清中和抗体效价滴度几乎为零,而疫苗免疫猪场血清中和抗体效价在54.1~74.9。本研究成功分离一株pedv毒株,生长特性良好,能在细胞上稳定传代培养。通过抗体中和试验,证明cv777疫苗株所在基因i群毒株与基因iii群流行毒株之间的免疫交叉性差。通过分离培养pedvchhen-zz毒株对pedv的病原学特性进行研究,为进一步研究pedv的免疫原性及交叉保护性提供参考。