第一部分:大鼠肝移植急性排斥反应模型的建立及经验总结[目 的]通过不断练习建立稳定的大鼠肝移植急性排斥反应模型,为后续的实验奠定模型基础。[方 法]通过经典的“二袖套”法进行大鼠肝移植手术,前期预实验使用SD大鼠进行模型建立的练习。模型建立稳定后,使用Lewis大鼠作为供体,BN大鼠作为受体建立大鼠肝移植术后急性排斥反应模型。术后随机将大鼠分为2组,实验组:非热量限制使用AMPK激动剂组:术后自由进食外,每日使用AMPK激动剂二甲双胍给予灌胃注药处理,60mg/kg。对照组:作为非热量限制的对照组,自由进食,不做任何处理。[结 果]预试验早期,肝移植术后48小时存活率:13%,平均无肝期时间:29.27±3.77min。预试验第二阶段中期肝移植手术后48小时存活率:40%,平均无肝期时间:25.07±1.33min。预试验第三阶段肝移植手术后48小时存活率:70%,平均无肝期时间:23.30±1.49min,大鼠肝移植模型建模稳定。正式实验总体肝移植手术成功率:76.6%,平均无肝期时间:21.15±2.25min,顺利建立肝移植急性排斥模型。[结 论]通过经典的“二袖套”法,成功建立大鼠肝移植急性排斥反应模型,影响成功率的主要因素是无肝期时间及SHVC的吻合效果。通过建立大鼠肝移植急性排斥反应模型为后续的实验奠定基础。第二部分:AMPK激动剂在非热量限制对排斥反应的影响[目 的]初步评估AMPK激动剂对非热量限制的大鼠肝移植术后术后急性排斥反应的作用。[方 法]使用第一部分建立的大鼠肝移植急性排斥反应模型,分别于术后7天、10天、14天,收集各组的血清检测TBIL、DBIL、ALT、AST、ALP表达情况,收集肝脏组织进行病理分析,按照Banff评分分析每组肝移植术后实验组及对照组排斥情况,使用RAI评分评估急性排斥程度。[结 果]实验组和对照组术后7天、10天、14天血清TBIL、DBIL、IBIL以及ALT、AST、ALP水平均无统计学差异。取移植肝组织,病理切片HE染色,按照Banff标准评估排斥反应程度,使用对应的RAI评分做出急性排斥诊断。结果显示在肝移植术后早期的7天及10天,非热量限制条件下使用AMPK激动剂二甲双胍组急性排斥反应的程度较对照组有减轻。而14天则无明显差异。[结 论]在非热量限制的条件下AMPK激动剂二甲双胍在大鼠肝移植急性排斥反应早期的7-10天内有减轻急性排斥反应的作用。第三部分:非热量限制条件下AMPK激动剂减轻大鼠肝移植术后排斥反应分子机制的研究[目 的]在非热量限制条件下,探究AMPK激动剂在大鼠肝移植术后排斥反应中减轻急性排斥反应可能的分子机制。[方 法]使用实验一取材的移植后大鼠的肝脏及血清,应用免疫组织化学染色技术,对实验组和对照组进行免疫组化染色。对比P-mTOR在实验组和对照组之间的差异,使用ELISA测量各组术后血清的IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ表达情况。并根据收集到的信息,探究非热量限制条件下,激活AMPK在抑制mTORC1对于大鼠肝移植术后急性排斥反应的影响。[结 果]免疫组化显示使用AMPK激动剂二甲双胍激活了 AMPK,影响了 mTOR的磷酸化。实验组和对照组术后7天、10天、14天的IL-2、IL-4、IL-10表达均无差异,而IL-12及IFN-γ在术后7天、10天,实验组组和对照组二者指标存在差异。AMPK激活后,在急性排斥反应早期IL-12、IFN-γ在血清表达下调,二者在术后14天的表达则无明显差异。[结 论]在非热量限制条件下,探究AMPK激活后,在早期延缓大鼠肝移植术后急性排斥反应的机制。其机制可能是通过抑制mTOR,在免疫代谢方面调节了 T细胞的代谢过程,延缓了 Th0向Th1的分化而发生作用。