宫颈癌是一种常见的妇科恶性肿瘤,严重威胁女性健康。紫杉醇（paclitaxel,PTX）作为一线化疗药物,在宫颈癌治疗中发挥着重要的作用。然而由于肿瘤的复杂性,传统化疗药物单一的抗肿瘤机制无法对抗癌症进展过程中复杂的信号通路变化。因此,针对不同靶点或不同抗癌机制的两种或两种以上药物的联合治疗方案一直备受关注。其中,化疗联合基因治疗作为新兴的治疗策略,在肿瘤治疗中具有良好的应用前景。基因治疗通过对涉及癌症进展及耐药的关键蛋白在生物合成水平上进行精确调控,有效地增强了化疗药物的抗肿瘤效果,而不对正常细胞产生毒性。基因治疗工具的血清不稳定性、多阴离子大分子特性及低细胞摄取特性仍然是其实现系统给药的主要障碍。为了发挥化疗联合基因治疗这一策略的全部潜能,迫切需要一种智能的、高生物相容性的纳米载药递送系统,使化疗药物和基因治疗工具能够精确协同递送,并在递送过程中保护基因治疗工具不被降解,同时被肿瘤细胞高效摄取。本课题拟构建一个安全有效的仿生纳米递送平台,即利用癌细胞膜伪装共载靶向E7的小干扰RNA（small interfering RNA targeting E7,si RNA-E7）和PTX的纳米递送系统,评估其体内外抗肿瘤效果,并探讨si RNA-E7对PTX的化疗增敏作用机制。研究目的:1、设计并构建He La细胞膜包裹的共载si RNA及PTX的PLGA纳米粒（Si/PNPs@He La）并表征;2、探讨细胞膜伪装对纳米粒摄取、转染效率、细胞杀伤作用的影响,以及si RNA-E7增敏PTX的机制;3、探讨细胞膜伪装对纳米粒循环时间、生物分布的影响,并对该递送系统的抑瘤效果及生物安全性进行评价。研究方法:1、通过复乳法制备共载si RNA和PTX的PLGA纳米粒（Si/PNPs）,通过机械挤压的方法使He La细胞膜包裹在纳米颗粒表面,得到Si/PNPs@He La。采用动态光散射激光粒度仪（DLS）、透射电镜（TEM）、荧光光谱仪、高效液相色谱仪（HPLC）对Si/PNPs@He La的粒径、电位、形貌、包封率及体外释放行为进行表征;2、通过蛋白凝胶电泳染色、Western blot、免疫纳米金染色、激光共聚焦显微镜等手段检测膜蛋白在纳米粒表面的保留情况;3、利用荧光显微镜定性观察包括He La细胞在内的不同细胞系对Si/PNPs及Si/PNPs@He La摄取行为的差异,并通过流式细胞仪定量观察上述摄取行为;4、设计并筛选能够高效敲降靶基因的si RNA序列;5、定量Real-time PCR及Western blot检测单载或共载的si RNA-E7纳米粒在细胞膜包裹前后的靶基因敲降能力;6、采用CCK-8法、Calcein AM/PI活-死细胞染色分别检测不同纳米粒对He La细胞的体外杀伤作用,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化;7、采用Western blot检测经PTX处理后He La细胞耐药相关蛋白的表达变化,探索si RNA-E7增敏作用的机制;8、通过小动物活体成像观察纳米粒在宫颈癌皮下异种移植瘤模型中的生物分布情况,并通过荧光显微镜观察肿瘤组织冰冻切片中两种共载成分各自的分布情况;9、利用ICR小鼠进行纳米粒的药物代谢动力学检测;10、应用皮下荷瘤小鼠模型评估纳米递送系统对He La细胞荷瘤小鼠的治疗作用和体内安全性。研究结果:1、成功制备了Si/PNPs和Si/PNPs@He La纳米粒。与裸纳米粒（Si/PNPs）相比,细胞膜包覆后的纳米粒（Si/PNPs@He La）粒径增加了约15nm,电位由-14.4m V变化为-30 m V,TEM显示膜包裹纳米粒存在核-壳结构;Si/PNPs中紫杉醇的包封率为90.2±0.43%,si RNA-E7的包封率为88.4±0.22%;体外释放实验提示纳米粒具有很好的缓释特性;2、蛋白凝胶电泳染色、Western blot证实了大部分He La细胞膜蛋白,尤其是细胞粘附及免疫逃逸相关蛋白成功转移到纳米粒表面;免疫纳米金染色提示纳米粒表面细胞膜以正确的方向进行包覆;激光共聚焦显微镜共定位提示纳米颗粒的核-壳结构在被细胞内化后的一段时间内仍保持稳定;3、与裸纳米粒相比,He La细胞膜包裹的纳米粒更易被同源细胞,即He La细胞摄取,且更易逃脱小鼠巨噬细胞RAW264.7的吞噬;4、通过检测目的基因在转染si RNA后的表达情况,筛选出有效序列si RNA-E7-93;5、Si/PNPs@He La24和48小时的基因敲降效率分别达到26.8±5.7%和75.2±0.6%,高于Si/PNPs;6、细胞杀伤作用在游离PTX组、PTX纳米粒组（PNPs）、Si/PNPs组和Si/PNPs@He La组中逐渐递增;Si/PNPs@He La 48小时诱导细胞凋亡比例可达71.51±4.88%;7、PTX可引起宫颈癌细胞磷酸化AKT（p-AKT）、MDR1表达水平增加,si RNA-E7可抑制p-AKT、MDR1蛋白的表达;8、小动物活体成像显示Si/PNPs@He La自8小时起富集于肿瘤部位,明显早于Si/PNPs;且荧光强度随时间逐渐增强,各时间点荧光强度均强于Si/PNPs;肿瘤组织冰冻切片提示纳米粒能够将两种药物成分同时递送至肿瘤部位;9、细胞膜包覆技术延长了纳米粒的血液循环时间;10、Si/PNPs@He La体内抑瘤率可达83.6%;免疫组化结果显示Si/PNPs@He La组肿瘤组织中E7蛋白表达量减少,Rb蛋白表达量增加;未观察到纳米粒对主要脏器的毒性作用。结论:本课题成功构建了He La细胞膜包裹的共载PTX和si RNA-E7的纳米载药递送系统（Si/PNPs@He La）。通过细胞膜包覆技术将He La细胞膜表面的粘附分子和免疫逃逸相关蛋白完整地转移纳米粒表面,使得Si/PNPs@He La获得同源肿瘤靶向性和免疫逃逸能力。该纳米递送系统高效递送si RNA-E7,敲降E7的表达,并由此抑制AKT通路的激活和MDR1的表达,增加He La细胞对PTX的敏感性,提高抗肿瘤效果,且未引起主要脏器的不良反应,为宫颈癌的治疗提供了新的思路。