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背景:非创伤性股骨头缺血坏死（Non-traumatic osteonecrosis of the femoral head,NONFH）是一种常见的骨科疾病,其早期诊断和治疗较为困难。迄今为止,NONFH主要的病理生理机制为成骨分化能力降低和血管生成能力下降,但是详细病理生理机制仍不清楚。骨髓间充质干细胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs）和血管内皮细胞（Vessel endothelial cells,VECs）都具有强大的增殖和分化潜力,在骨组织的修复与重建中起到了巨大的作用。但是,我们发现即使去除了致病因素,NONFH的病程仍然不能被逆转,患者的坏死区骨组织表现为骨形成和血管生成受限。于是,我们推测,可能是患者的坏死区骨组织释放了某些信号,影响了患者自身BMSCs和VECs的修复效果。外泌体是一种细胞来源的小囊泡,主要是通过旁分泌的方式参与细胞信号传导。人体内几乎所有的细胞都可以合成分泌外泌体,同时几乎所有的细胞都接收外泌体的信号传导,于是我们推测NONFH患者的坏死区骨组织通过释放外泌体影响了本病的治疗与进展。miRNAs被报道可以参与到多种骨科疾病的发生发展。基于此,我们从人体骨组织,细胞以及动物这几个层面探讨NONFH坏死区骨组织来源的外泌体（NONFH外泌体）在本病发展中的作用,同时结合miRNA测序,对于NONFH外泌体影响本病的分子机制进行了进一步阐述,以期为本病提供有效的治疗靶点。目的:本课题旨在探究NONFH外泌体对于成骨分化、血管生成和大鼠股骨头的影响;探究NONFH外泌体中的miRNA表达谱变化;对于筛选出的miRNA,进一步验证其功能,并通过双荧光素酶报告和RNA干扰等技术,探讨NONFH外泌体致病的的分子机制,为NONFH的提供新的治疗靶点。材料与方法:1.临床样本特征和外泌体的提取与鉴定:在髋关节置换术中收取30例股骨颈骨折（Femoral neck fracture,FNF）的股骨头样本（FNF组作为对照）和30例NONFH的股骨头样本,同时收集病人的临床数据和X线片,筛选出年龄、性别、BMI没有统计学差异的股骨头。对收集到的FNF样本和NONFH样本,应用H&E染色和免疫组化观察组织学变化。采用超高速离心的方法提取外泌体,通过透射电镜（Transmission electron microscopy,TEM）、纳米粒子跟踪分析（Nanoparticle tracking analysis,NTA）和检测外泌体标志物对外泌体进行了鉴定。使用外泌体摄取实验观察人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs）和人脐静脉微血管内皮细胞（human umbilical vessel endothelial cells,HUVECs）对外泌体的摄取。2.NONFH在体内和体外的致病作用:将hBMSCs和HUVECs分为3组:PBS组、FNF外泌体组和和NONFH外泌体组。将处理后的hBMSCs培养在成骨诱导培养基或成脂诱导培养基中,使用碱性磷酸酶染色和茜素红S（Alizarin red S,ARS）染色评估hBMSCs的成骨分化情况,使用油红O（oil red O,ORO）染色评估hBMSCs的成脂分化情况。将处理后的HUVECs接种于基质胶中,使用小管形成实验评估HUVECs的血管形成能力。使用划痕实验评估NONFH外泌体对hBMSCs和HUVECs迁移能力的影响。将NONFH外泌体经尾静脉注射到大鼠中,探究其对大鼠股骨头的影响。进一步使用RT-PCR和western blot探讨NONFH对成骨和血管生成的影响。3.差异miRNA的筛选以及差异性表达miR-100-5p的功能验证:随机提取3组NONFH外泌体和3组FNF外泌体中的miRNA,通过miRNA测序筛选差异miRNA,再通过RT-PCR进行验证。将NC、agomiR-100-5p（miR-100-5p的激动剂）、antagomiR-100-5p（miR-100-5p的拮抗剂）转染进入正常的hBMSCs和HUVECs中,模拟过表达miR-100-5p和低表达miR-100-5p。将转染后的hBMSCs进行成骨诱导和成脂诱导,使用ALP染色、ARS染色评估成骨分化,使用ORO染色评估成脂分化。使用小管形成实验探究HUVECs的血管形成能力。进一步使用western blot探讨miR-100-5p对成骨和血管生成的影响。4.miR-100-5p抑制成骨分化和血管形成的机制:使用Target Scan7.2网站预测miR-100-5p的靶基因,再通过双荧光素酶基因报告实验证明靶向关系。将hBMSCs和HUVECs分为3组:NC组、si BMPR2组和si BMPR2+antagomir-100-5p组。构建靶基因的小干扰RNA（siRNA）敲低靶基因,通过“挽救实验”方法（即敲低靶基因的同时抑制miR-100-5p的表达）探讨靶基因相关的信号通路。进一步使用western blot探讨靶基因对成骨和血管生成的影响。5.antagomiR-100-5p挽救NONFH外泌体引起的损伤的机制:将hBMSCs和HUVECs分成4个组,分为PBS组,NONFH外泌体组,NONFH外泌体+NC组（处理NONFH外泌体的同时转染NC）,NONFH外泌体+antagomiR-100-5p（处理NONFH外泌体的同时转染miR-100-5p的拮抗剂）。使用ALP染色、ARS染色、ORO染色和小管形成实验证明antagomiR-100-5p可以挽救NONFH外泌体引起的损伤。进一步使用western blot探讨antagomiR-100-5p对拮抗NONFH外泌体的机制。结果:1.NONFH患者坏死区骨组织呈现出成骨和血管形成降低,脂肪生成增加,表现为:RUNX2、CD31、FGF2、OPN和ALP等成骨成血管标志物下降,PPARγ这一成脂分化标志物升高。NONFH外泌体和FNF外泌体被成功从骨组织中分离,并可以被hBMSCs和HUVECs摄取。2.NONFH外泌体可导致hBMSCs成骨分化减弱:成骨诱导后ALP染色所见的蓝色颗粒减少,ARS染色中矿化结节下降,OCN、RUNX2、Collagen type 1、OPN和ALP等成骨标志物下降;NONFH外泌体促进hBMSCs的脂肪分化:成脂分化转录因子PPARγ的蛋白和基因表达均增加,成脂诱导后,细胞内的脂滴增加;NONFH外泌体可以抑制HUVECs的血管生成:血管形成标志物VEGFA和FGF2下降,形成的完整小管数量下降。NONFH外泌体也可导致大鼠股骨头骨小梁变薄、塌陷等类似于NONFH的病理改变。3.MiRNA测序和RT-PCR证明miR-100-5p在NONFH外泌体中上调。过表达miR-100-5p可以抑制hBMSCs的成骨分化:成骨诱导后ALP染色所见的蓝色颗粒减少,ARS染色中矿化结节下降,OCN、RUNX2、Collagen type 1、OPN和ALP等成骨标志物下降。过表达miR-100-5p促进hBMSCs的脂肪分化:成脂分化转录因子PPARγ的蛋白表达增加,成脂诱导后,细胞内的脂滴增加;过表达miR-100-5p可以抑制HUVECs的血管生成:血管形成标志物VEGFA和FGF2下降,形成的完整小管数量下降。4.WB和双荧光素酶基因报告试验证明BMPR2是miR-100-5p的直接靶基因。敲低BMPR2可以抑制hBMSCs的成骨分化:成骨诱导后ALP染色所见的蓝色颗粒减少,ARS染色中矿化结节下降,OCN、RUNX2、Collagen type 1、OPN和ALP等成骨标志物下降。敲低BMPR2促进hBMSCs的脂肪分化:成脂分化转录因子PPARγ的蛋白表达增加,成脂诱导后,细胞内的脂滴增加;敲低BMPR2可以抑制HUVECs的血管生成:血管形成标志物VEGFA和FGF2下降,形成的完整小管数量下降。敲低BMPR2可以在hBMSCs和HUVECs中抑制SMAD1/5/9的磷酸化。挽救实验证明沉默miR-100-5p可以挽救敲低BMPR2带来的损害。5.沉默miR-100-5p可以减轻NONFH外泌体对hBMSCs成骨分化的抑制作用:成骨诱导后ALP染色所见的蓝色颗粒和ARS染色中矿化结节增加,OCN、RUNX2、Collagen type 1、OPN和ALP等成骨标志物上升。沉默miR-100-5p降低NONFH外泌体对hBMSCs成脂分化的促进作用:成脂分化转录因子PPARγ的蛋白表达降低,成脂诱导后,细胞内的脂滴减少;沉默miR-100-5p减少NONFH外泌体对HUVECs血管形成的抑制作用:血管形成标志物VEGFA和FGF2升高,形成的完整小管数量增加。结论:1.坏死区骨组织成脂标志物表达上调,成骨标志物以及血管生成标志物表达下降。FNF外泌体和NONFH外泌体被成功从骨组织分离,且可以被hBMSCs和HUVECs摄取。2.NONFH外泌体可以抑制成骨分化和血管形成,促进脂肪分化,导致大鼠股骨头出现NONFH改变。3.NONFH外泌体携带了大量miR-100-5p,miR-100-5p通过靶向BMPR2和抑制BMPR2/Smad1/5/9通路,抑制hBMSCs的成骨和HUVECs的血管形成。4.沉默miR-100-5p可以减少对BMPR2的抑制,激活BMPR2/Smad1/5/9通路,减轻NONFH外泌体对成骨分化和血管形成的抑制作用。