背景乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是最严重和最普遍的健康问题之一,全世界约有20亿人受累。尽管从1982年开始使用HBV疫苗后,HBV感染率大为下降,全世界至今仍有超过3.5亿的慢性HBV携带者,其中约75%分布于亚太平洋地区。随着感染时间延长,HBV感染者发生肝脏功能失代偿、肝硬化、肝细胞癌的风险亦逐渐增加,全世界每年约有50-120万人死于HBV感染相关的终末期肝病。我国约有1.2亿HBV感染者,其中2000-3000万为慢性活动性肝病患者。因此,慢性HBV感染依然是一个具挑战性的全球健康问题。HBV感染的结局与宿主的免疫状态密切相关,其中机体对HBV的免疫耐受而导致特异性细胞毒性T细胞（CTL）应答不足是导致HBV感染慢性化的重要原因。慢性HBV感染的免疫学特点主要有:①存在不同程度的免疫耐受。HBV感染病例外周血中有大量病毒抗原,血液高浓度的病毒抗原长期刺激,可能诱导产生更多的Treg细胞,PD-1及CTLA-4等免疫抑制分子表达上调,从而使病毒特异性细胞免疫反应低下或缺失。②抗原提呈细胞特别是树突状细胞（DC）数量较少或功能缺陷,影响DC-T细胞间的相互作用,致使HBV抗原特异性T细胞HLA-Ⅱ表达下降,导致T细胞应答减弱、增殖不足,不能激活Th细胞产生细胞因子、或不能激活CTL的细胞毒活性;③HBV特异性TCR CDR3谱型较窄或峰形偏倚,T细胞呈单克隆性或寡克隆性增生,从而使机体对HBV抗原的识别及应答谱较窄;④Ⅰ型及Ⅱ型辅助性T淋巴细胞（Helper T lymphocyte,Th）失平衡。在病毒复制部位T细胞分泌的细胞因子型可能影响感染的最后结局,特异性Th1细胞占优势时,可促进细胞免疫反应,有利于清除病毒;而Th2细胞占优势时,虽然有利于产生针对HBV的抗体,但容易使感染慢性化。慢性HBV感染者Th1型细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2等）相对不足,而Th2型细胞因子（IL-4、IL-10等）水平相对较高,因而维持慢性感染状态。⑤抗病毒相关的细胞因子（TNF-α及IFN-γ等）可能存在基因突变、基因多态性或信号转导过程的异常。随着对乙型肝炎病毒学、免疫学及慢性感染自然史认识的提高,目前公认HBV复制是免疫介导肝损伤和疾病进展的关键驱动者。自1998年以来,一些有效的口服抗病毒药物的批准使用使乙型肝炎的治疗发生了革命性的变化。目前批准用于抗HBV治疗的药物分两大类,注射用的干扰素（普通干扰素和长效干扰素）及口服的核苷（酸）类似物（拉米夫定、阿德福韦、替比夫定和恩替卡韦等）。这些药物可有效的抑制病毒复制和阻止疾病进展,但却不能完全清除病毒;核苷（酸）类似物长期治疗的耐药问题也是一个很大的缺陷。因此,我们需要寻找新的药物或治疗策略来提高慢性乙型肝炎治疗的效果。近年,医用臭氧用于治疗乙型病毒性肝炎成为一种新的探索。医用臭氧是臭氧与医用纯氧的混合气体,可用于治疗风湿、溃疡性结肠炎、椎间盘突出症等多种疾病。臭氧作用全血后产生活性氧（ROS,主要是H₂O₂）和脂质过氧化产物（LOPs）,这两种产物分别作用于血液中的各种成分（单核细胞、血小板、红细胞、白细胞）及内皮细胞和其他器官,产生各种效应,近年来过氧化氢（H₂O₂）被认为是动、植物细胞中一个重要的细胞内信使,因此臭氧是通过其反应产物间接发挥作用。中国大陆在2004年底开始臭氧治疗乙型病毒性肝炎的尝试并且初见疗效,医用臭氧有望成为治疗慢性乙型肝炎的一种新的策略。但其作用机制不清楚。既往研究推断医用臭氧具有免疫调节作用,但尚需进一步证实,因此,研究医用臭氧的免疫作用机制具有重要的临床意义。目的通过研究医用臭氧体外对慢性乙型病毒性肝炎（CHB）患者外周血单个核细胞（PBMC）分泌细胞因子功能的影响,1.探索臭氧治疗CHB的细胞免疫学机理;2.为医用臭氧治疗CHB提供基础研究的证据,促进并推广其在临床上的应用;3.为CHB的治疗寻找新策略,提高治疗效果。方法1.酶联免疫吸附试验（ELISA）检测臭氧作用后CHB患者PBMC培养上清中IFN-γ和IL-4水平:分别采集11例CHB患者和8例健康献血员外周血10ml,密度梯度离心法分离PBMC,用RPMI 1640完全培养基重悬后,以不同浓度（4、10、20、40、80μg/mL）的医用臭氧冒泡法作用后,于37℃含5%CO₂的细胞培养箱中培养72小时;设置医用纯氧（O₂,冒泡法作用）、阳性（PHA 10μg/ml刺激）、阴性（RPMI 1640基础培养基）及双复孔自身对照组。培养结束后,ELISA检测各处理组PBMC培养上清液中IFN-γ和IL-4的浓度,操作步骤按照试剂盒说明书进行。2.流式细胞术（FCM）检测臭氧作用后CHB患者CD4+和CD8+T细胞中IFN-γ和IL-4阳性细胞的比例:分别采集8例CHB患者和6例健康献血员外周血10ml,密度梯度离心法分离PBMC,用RPMI 1640完全培养基重悬后,以不同浓度（4、10、20、40、80μg/mL）的医用臭氧冒泡法作用后,于37℃含5%CO₂的细胞培养箱中培养1小时,加入蛋白转运阻断剂（Brefeldin A,终浓度10μg/ml）,于37℃含5%CO₂的细胞培养箱中继续培养5小时;设置医用纯氧（O₂,冒泡法作用）、阳性（PHA 10μg/ml刺激）、阴性（RPMI 1640基础培养基）对照组。培养结束后,用不同荧光染料标记的抗体对细胞表面分子CD4及CD8进行染色,固定破膜后用IFN-γ及IL-4荧光抗体对细胞内细胞因子进行染色。用流式细胞仪分别检测CD4⁺及CD8⁺T淋巴细胞中IFN-γ及IL-4阳性细胞的百分率,并用CellQuest软件分析结果。3.统计分析:本研究采用2×8析因设计,即比较两组人群（CHB患者和健康志愿者）分别接受8种不同处理（5个实验组和3个对照组）的差异。两组人群之间及8种不同处理组之间整体差异的比较采用析因设计资料的方差分析;两组人群内部各处理组整体差异的比较用单因素方差分析;两组人群之间各个实验组及对照组的比较采用两独立样本t检验;同一组人群各实验组与对照组之间的比较采用配对t检验;所有数据均采用SPSS13.0软件进行统计分析,检验水准P＜0.05认为有统计学差异。结果1.两组人群阳性对照组IFN-γ及IL-4浓度及CD8⁺和CD4⁺阳性细胞的比例均显著高于其他处理组（P＜0.05）。2.CHB患者PBMC经过臭氧处理后分泌IFN-γ浓度的整体水平显著高于健康志愿者（F=12.097,P=0.001）,而IL-4的整体水平略低于健康志愿者,但无统计学差异（F=1.822,P=0.179）。两人群组内不同臭氧浓度处理IFN-γ及IL-4浓度的整体水平均有显著统计学差异（P＜0.05）,低浓度（4μg/mL、10μg/mL）臭氧可轻微刺激IFN-γ和IL-4的分泌,而高浓度（40μg/mL、80μg/mL）臭氧则有抑制作用。3.CHB患者CD8⁺细胞中IFN-γ阳性细胞的比例显著高于健康对照组（F=5.101,P=0.026）,CD4⁺细胞中IFN-γ阳性细胞比例均数高于健康对照组（阳性对照组除外）,但无统计学差异（F=0.034,P=0.845）,CHB患者及健康人群组各臭氧处理组间CD8⁺细胞中IFN-γ阳性细胞的比例均有显著差异（P=0.001及P=0.043）,两组人群各臭氧处理组间CD4⁺细胞中IFN-γ阳性细胞的比例均无显著差异（P＞0.05）。两组人群间CD8⁺及CD4⁺细胞IL-4阳性细胞比例总体水平无显著统计学差异（P＞0.05）,平均水平高低亦无明显趋势。CHB患者各臭氧处理组间CD8⁺及CD4⁺细胞中IL-4阳性细胞的比例均无显著差异（P＞0.05）,健康人群组各臭氧处理组间CD8⁺及CD4⁺细胞中IL-4阳性细胞的比例均有显著差异（P=0.019及P=0.009）。随着医用臭氧浓度的升高IFN-γ及IL-4阳性细胞的比例逐渐降低,可见低浓度医用臭氧对PBMC有轻微刺激作用,而高浓度时则抑制PBMC分泌细胞因子。结论1.臭氧体外作用对CHB患者PBMC分泌细胞因子的功能有影响,可促进Th1型细胞因子（IFN-γ）表达,而对Th2型细胞因子（IL-4）的表达无显著作用。2.臭氧体外对CHB患者PBMC分泌细胞因子的影响与臭氧刺激浓度剂量密切相关,低浓度臭氧可增强Th1型细胞免疫,而高浓度臭氧有抑制作用。3.臭氧体外作用CHB患者和健康人PBMC后,对其细胞因子分泌功能的影响存在差异,对CHB患者影响较大。