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蛋白质的酪氨酸硝基化与动植物的生理和病理进程密切相关。在诸多人类疾病中,包括糖尿病、神经退行性疾病、癌症等,特定蛋白质的酪氨酸硝基化水平会增高。然而蛋白质中硝基化酪氨酸的丰度极低,对硝基化位点进行鉴定之前需要进行预分离和富集。目前最常用的预分离方法主要依赖于抗体,成本较高,且对特定的酪氨酸硝基化多肽序列具有偏爱性。本研究采用噬菌体肽库技术,筛选硝基化酪氨酸肽的亲和肽,以期用于硝基化多肽的富集。我们首先以硝基化GGGGY*GGG为靶标,从M13噬菌体随机12肽库中,逐轮减低靶标浓度,进行四轮筛选,结合酶联免疫吸附分析,筛选得到阳性噬菌体单克隆。其中重复性最高的阳性噬菌体克隆表达序列为TLWPFDLWLKTR的外源12肽,重复率高达56.25%,命名为NT-1。并对NT-1与GGGGY*GGG之间的亲和力进行测定。在体系中,当固定到基质上的GGGGY*GGG浓度为3.2μM,游离NT-1的浓度分别为6μM,3μM,1.5μM,0.75μM,0.3μM,30 n M,3 n M,0.3n M时,NT-1均可被富集。在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）鉴定结果中,被富集的NT-1的信噪比（Signal/Noise,S/N）分别为1249.8,640.8,53.8,263.1,70.0,150.2,39.8,16.7。进一步在有牛血清白蛋白（Bovine serum albumin,BSA）胰蛋白酶酶解肽段存在的条件下,试验NT-1对GGGGY*GGG的特异性。在体系中,固定到基质上的GGGGY*GGG浓度为6.25μM,游离NT-1的浓度为2μM,加入的BSA酶解产物与NT-1的质量比为100和200倍时,富集到的NT-1的信噪比分别为100.0和77.7;当固定到基质上的GGGGY*GGG浓度为62.5μM,游离NT-1的浓度为220 n M,加入BSA酶解产物与NT-1的质量比为500和1000倍时,富集后样品中分别能鉴定到信噪比为7.2和6.8的NT-1。显示在半复杂样品中,NT-1对GGGGY*GGG具有较好的亲和力和特异性。接着,为了检测NT-1对不同类型硝基化酪氨酸多肽的富集效果,我们对文献报道的4547条硝基化酪氨酸多肽的序列进行生物信息学分析,主要归为8类,即疏水性,疏水性-酸性,酸性-疏水性-酸性,酰胺-疏水性-碱性,疏水性-碱性,碱性,酸性-丝氨酸,丝氨酸等氨基酸分别包裹硝基化酪氨酸的肽段。我们根据上述硝基化肽段的特异性序列模式（Motif）从中选择相应的短表位硝基化酪氨酸标准肽,即GGY*VA,GIY*EA,EY*LEE,NY*LK,AY*RQ,GY*KKL,DY*SG,SY*ST,并在偶联基质的一端填充甘氨酸充当柔性臂,即后续试验中所谓的硝基化酪氨酸标准肽。将硝基化酪氨酸标准肽与不同浓度BSA酶解产物混合,以探究NT-1对这些硝基化肽段的富集能力及选择性。当体系中固定到基质上的NT-1浓度为1μM,游离硝基化肽浓度为0.8μM,加入的BSA酶解产物的质量比为25倍和50倍时,MALDI-TOF质谱鉴定结果显示,NT-1能富集到7或8条（GGGGAY*RQ与NY*LKGGGG分子量相同）硝基化酪氨酸标准肽。在含200倍BSA时,NT-1能富集到上述除GGGGDY*SG外的6或7条（GGGGAY*RQ与NY*LKGGGG分子量相同）硝基化酪氨酸标准肽。在含500和1000倍BSA酶解产物时,NT-1能富集到GGGGIY*EA和GGGGSY*ST。采用MALDI-TOF质谱鉴定时,偶联基质在洗脱时的降解产物在500～1000 Da区段有较高的吸收峰,这些峰与硝基化酪氨酸标准肽,特别是GGGGGY*VA的目的峰有重叠。我们将硝基化酪氨酸标准肽偶联到固相基质上,反向富集NT-1多肽,结合质谱分析以进一步验证。体系中,8种硝基化酪氨酸标准肽分别固定到基质上（浓度均为6.25μM）,游离NT-1浓度为2μM,加入不同比例BSA酶解产物中共孵育,质谱鉴定被富集到的NT-1。当NT-1与BSA酶解产物的质量比为1:50到1:200时,8种硝基化酪氨酸标准肽均能富集到NT-1,证实了NT-1与各种短表位硝基化酪氨酸肽段的相互作用。继而将NT-1应用于生物样品蛋白酶解所得的内源性酪氨酸硝基化肽的富集。根据文献,共合成10条典型的内源性酪氨酸硝基化肽,即SSQESY*AHGTK,TLSSY*STPK,DFMNEEY*SQEVR,QIDNP DY*KG,EDQTEY*LEER,EGVLY*VGSK,LLLGGGSY*K,AGN TIHAILLY*R,LFEMAY*KK,SVSSSSY*R。以NT-1为固定相（10μM）,富集游离的内源性酪氨酸硝基化肽（0.8μM）。在不加BSA酶解产物时,质谱结果显示NT-1能富集到其中8条内源性硝基化肽,分别为:SVSSSSY*R,LLLGGGSY*K,EGVLY*VGSK,LFEMAY*KK,QIDNPDY*KG,AGNTIHAILLY*R,DFMNEEY*SQEVR,ED QTEY*LEER。接着,测定不同浓度BSA酶解产物存在时,NT-1对内源性硝基化肽的富集能力。在上述体系中,当加入250倍质量比的BSA酶解产物时,NT-1仍能富集到上述8条内源性硝基化肽。当加入1000倍质量比的BSA酶解产物时,NT-1仍能富集到上述除DFM NEEY*SQEVR外的7条内源性硝基化肽。总之,利用噬菌体展示技术来筛选硝基化酪氨酸亲和肽,以期用于硝基化酪氨酸肽段的富集,是一种有效的方法。本研究筛选所得的NT-1亲和肽对各种典型的硝基化酪氨酸肽段具有一定的亲和力。并有望应用于更为复杂环境中的内源性酪氨酸硝基化肽段的富集。