目的 静脉材料仍是目前冠状动脉旁路移植术(CABG)与外周动脉损伤修复手术等常用的血管材料,但其存在的主要缺点是再狭窄(restenosis)发生率高,严重影响了其远期疗效。但是移植静脉再狭窄的机制尚不完全清楚,还没有特异的、有效的治疗方法。目前认为,静脉移植物(vein graft, VG)再狭窄与血流动力学环境变化密切相关,是引起VG 再狭窄的主要病因之一。VG 为适应动脉力学环境,结构发生重塑(remodeling),静脉内膜和中层增生,管壁增厚。在增生内膜基础上 VG 发生粥样硬化样改变,管腔狭窄与闭塞。最近,根据生物力学工程原理在移植静脉外加外支撑的方法(外套管)已被证明能有效减轻 VG 内膜增厚,对提高 VG 的远期通畅率有一定帮助。以前的研究大多使用的都是不可降解的材料,而对使用聚乳酸-聚乙醇(PLGA)等可降解吸收材料的研究较少。对可降解材料外套管对静脉影响的长期结果还未见报道。 不可降解的医用材料具有较好的生物相容性,能起到外支撑的作用,但是长期存在于机体内可能会发生局部感染、血管外膜纤维化等。而可降解材料同样有较好的生物相容性,具有一定的力学强度和弹性,在术后早期能起到外支撑作用,抑制静脉内膜增生;在一定时间后外套管降解,而且其降解与静脉重塑同步进行,有利于静脉继续向良性方向重塑;降解产物对机体无毒性并被机体吸收。因此,研究可降解材料更适合做外套管,对抑制 VG 内膜增生和防止VG 再狭窄的作用有重要意义。理想的可降解外套管材料应具备以下特点:①材料生物相容性好,降解产物对机体无毒性或低毒性;②外套管有一定力学强度,在术后早期能发挥外支撑作用;③外套管有一定弹性和顺应性;④外套管有合适的孔隙,周围的滋养血管可长入外套管;⑤外套管降解与静脉重塑同步,能较好地抑制 VG 内膜增生。 因此,本课题以可降解材料聚乳酸-聚乙醇(PLGA)作为外套管材料,研究 PLGA外套管移植静脉抑制 VG 内膜增生的可行性以及长期效果观察;探索 VG 再狭窄和可降解外套管抑制 VG 内膜增生的分子生物学和生物力学机制。 - 2 -<WP=7>第二军医大学博士学位论文 中文摘要 胸心外科专业 方法 1、PLGA 的生物学评价 对本实验使用的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)进行了细胞毒性试验、皮下包埋试验,以评价其细胞毒性、组织相容性及降解时间。细胞形态学观察法观察 2~7 天L-929 细胞在受试材料边缘的生长情况及细胞形态变化;用 PLGA、阴性和阳性对照材料浸提液培养细胞,MTT 法测定 L-929 细胞的相对增殖率及细胞毒性。将 PLGA 及阳性对照等材料埋置于 SD 大鼠皮下,分别于术后 3 天、2、4、6、8、12 周观察材料周围组织炎性细胞浸润程度、包裹组织厚度。 2、PLGA 外套管减轻移植静脉内膜增生的动物模型的建立及可行性研究 制作内径 0.4cm 长 6cm 的 PLGA 圆柱空心管;将杂种犬的股静脉调转以端-端吻合方式移植到同侧的股动脉,其中一侧静脉加 PLGA 材料的外套管(外套管组),另一侧静脉单纯移植(对照组)。术后 3d,2、4、6、12 周再次手术取出静脉。根据 HE 染色切片测量静脉内膜、中层厚度及面积;维多利亚蓝-丽春红染色观察胶原纤维和弹力纤维的变化;扫描电镜观察静脉壁内皮细胞完整性及形态变化;免疫组化兔抗人VIII因子相关抗原抗体染色评价静脉内皮细胞的完整性,免疫组化鼠抗人平滑肌α-actin 抗体染色观察静脉壁平滑肌细胞分布。配对比较对照组和外套管组之间的差异。 3、PLGA 外套管减轻移植静脉内膜增生的力学机制 静脉移植后即刻及再次手术前,电磁流量计测量外套管组和对照组的移植静脉中段流量波形,超声多普勒测量移植静脉中段的内径,根据公式计算静脉中段的壁面切应力(WSS)变化。静脉移植术后 12 周再次手术取出静脉,血管力学检测仪测量静脉的 p-V 关系,测量静脉零应力状态下的张开角,利用指数函数公式拟合,计算静脉壁周向应力及沿静脉壁分布。 4、PLGA 外套管减轻移植静脉内膜增生的分子生物学机制 静脉移植术后 24 周再次手术取出静脉,根据 HE 染色测量静脉内膜、中层厚度及面积;维多利亚蓝-丽春红(VB)染色观察胶原纤维和弹力纤维的变化;透射电镜观察静脉内膜和中层的炎性细胞浸润、平滑肌细胞增殖和凋亡、细胞外基质变化;免疫组化鼠抗人平滑肌α-actin 抗体染色观察静脉壁平滑肌细胞分布,免疫组化细胞增殖核抗原(PCNA)抗体染色检测静脉壁增殖细胞,原位 DNA 片段末端标记(TUNEL)法检测静脉壁凋亡细胞,免疫组化兔抗人转移生长因子(TGF)-β、基质金属蛋白酶(MMP)-2、9、基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1 抗体染色检测静脉壁 TGF-β、MMP-2、 - 3 -<WP=8>第二军医大学博士学位论文 中文摘要 胸心外科专业9、TIMP-1 的分布;Western blot 法半定量检测静脉壁 TGF-β、MMP-2、9、TIMP-1的蛋白质表达。配对比较对照组和外套管组的差异。 实验结果 1、PLGA 的生物相容性 细胞毒性试验表明,PLGA 组细胞贴壁生长良好,对细胞的增殖无明显不良影响,与阳性对照组差异显著;皮下包埋试验观察 12 周, PLGA 材料外周