【摘 要】
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目的:由于局部微环境中代谢紊乱、血糖升高、过表达的促炎性细胞因子和蛋白酶（如基质金属蛋白酶;MMPs）等因素的影响,糖尿病（DM）通过干扰骨稳态显著损害骨缺损修复再生。随着糖尿病发病率的增加及个体血糖控制不良,大量糖尿病患者遭受骨愈合不良的困扰。然而,传统的骨缺损治疗方法受到血管化欠佳、病理微环境的不良影响等问题的限制。为解决这一临床问题,本研究旨在探究根尖牙乳头干细胞来源外泌体（SCAP-Exo
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目的:由于局部微环境中代谢紊乱、血糖升高、过表达的促炎性细胞因子和蛋白酶（如基质金属蛋白酶;MMPs）等因素的影响,糖尿病（DM）通过干扰骨稳态显著损害骨缺损修复再生。随着糖尿病发病率的增加及个体血糖控制不良,大量糖尿病患者遭受骨愈合不良的困扰。然而,传统的骨缺损治疗方法受到血管化欠佳、病理微环境的不良影响等问题的限制。为解决这一临床问题,本研究旨在探究根尖牙乳头干细胞来源外泌体（SCAP-Exo）对血管生成和骨生成的影响及相关作用机制,评估负载SCAP-Exo的微环境响应性PEG/DNA杂化水凝胶系统促进糖尿病大鼠血管化骨再生的能力。方法:1.酶消化法分离培养根尖牙乳头干细胞（SCAPs）和牙髓干细胞（DPSCs）;通过成骨、成软骨和成脂诱导检测其多向分化能力;流式细胞仪检测干细胞表面标志物。梯度离心法分离提取SCAPs来源外泌体（SCAP-Exo）和DPSCs来源外泌体（DPSC-Exo）,并通过TEM、NTA、Western Blot对两种外泌体进行鉴定。通过CCK-8、Transwell、q RT-PCR方法比较SCAP-Exo和DPSC-Exo对HUVECs和MC3T3-E1细胞增殖、迁移和分化的影响。2.通过CLSM、Transwell、q RT-PCR、成管实验、ALP染色、ARS染色等方法验证SCAP-Exo在生理及高糖炎症条件下对HUVECs和MC3T3-E1细胞迁移、分化的影响。3.通过mi RNA测序技术、靶基因预测和功能富集分析探究SCAP-Exo中参与血管生成及骨生成的mi RNA;并通过q RT-PCR、mi RNA mimics转染方法在HUVECs和MC3T3-E1细胞中进行验证。4.通过流变学测试检测PEG/DNA杂化水凝胶的粘弹性能、自愈合性能及力学性能;通过SEM和CLSM检测该凝胶的孔径结构及SCAP-Exo分布;通过检测不同条件下外泌体释放率验证该凝胶对MMP-9的响应能力。5.使用STZ诱导糖尿病大鼠;通过micro-CT、HE染色、免疫荧光染色评价负载SCAP-Exo的PEG/DNA杂化水凝胶对糖尿病大鼠血管化骨再生的作用。结果:1.成功分离培养SCAPs和DPSCs,细胞呈典型的纺锤体干细胞形态;SCAPs和DPSCs具有多向分化能力;阳性表达干细胞表面标志物,阴性表达造血干细胞和白细胞表面标志物。成功分离提取SCAP-Exo和DPSC-Exo,形态呈典型的圆盘状双层膜结构;SCAP-Exo和DPSC-Exo粒径范围为100-150 nm;阳性表达外泌体标志性蛋白,阴性表达内质网蛋白。相较于DPSC-Exo,SCAP-Exo具有更好的同时促进HUVECs和MC3T3-E1迁移、分化的能力。2.SCAP-Exo可以成功被HUVECs和MC3T3-E1摄取。SCAP-Exo可以促进生理条件下HUVECs和MC3T3-E1的迁移、分化,且最佳使用浓度为10μg/ml;SCAP-Exo也可以促进高糖炎症条件下HUVECs和MC3T3-E1的迁移、分化。3.SCAP-Exo中高表达的mi R-126-5p、mi R-150-5p可能分别在血管生成和骨生成中发挥作用;HUVECs、MC3T3-E1摄取SCAP-Exo后,细胞中mi R-126-5p或mi R-150-5p的表达上调;使用mi R-126-5p mimics或mi R-150-5p mimics转染HUVECs、MC3T3-E1后,血管生成相关基因、骨生成相关基因表达上调。4.成功制备微环境响应性PEG/DNA杂化水凝胶;该凝胶具有良好的粘弹性能、自愈合性能及力学性能;内部具有均匀孔隙结构,孔径约为500 nm,SCAP-Exo可以均匀加载在凝胶内;该凝胶可以响应MMP-9并控制性释放SCAP-Exo。5.证实糖尿病大鼠的骨愈合能力受损;负载SCAP-Exo的PEG/DNA杂化水凝胶对糖尿病大鼠的血管化骨再生具有促进作用。结论:本研究首先在体外证实了SCAP-Exo具有促进血管生成和骨生成的双重作用;开发了负载SCAP-Exo的微环境响应性PEG/DNA杂化水凝胶系统,该智能系统通过响应糖尿病微环境中高表达的MMP-9以实现双功能SCAP-Exo的可控性释放;体内实验验证了该系统对糖尿病骨缺损修复再生具有促进作用。本研究为糖尿病患者骨愈合不良提供了一种有前途的替代疗法。
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