目的:疟疾是全球范围的公共卫生问题,具有严重的社会危害和复杂的致病机制。疟疾成为难治愈性疾病的主要原因是宿主缺乏长期有效的抗疟免疫应答。疟疾流行区人群获得抗疟天然抵抗有赖于多次重复的疟原虫感染,但免疫记忆难以长期维持。因疟疾疫苗尚未获得理想的免疫保护作用,抗疟药物仍然是治疗和预防疟疾发生的主要手段。目前,青蒿琥酯(Artesunate,AS)是用于重症疟疾治疗的首选药物。以往研究侧重于AS用药剂量、给药时长和副作用观察,缺乏对AS治愈个体在疟原虫再感染中的免疫保护机制研究。同时,AS在实验动物模型中的用药效果存在差异,其给药途径和用药时间均可能对治疗效果产生影响。为此,本研究通过筛选AS给药剂量、用药时间并配合相应的疟原虫感染浓度,获得了致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii 17XL,P.y 17XL)易感鼠(BALB/c)的AS治愈鼠。进一步对AS治愈鼠在P.y 17XL再感染中的抵抗机制进行了探讨,旨在为改良疟疾辅助治疗和疫苗设计提供参考。实验方法:1.动物模型制备:雌性BALB/c小鼠(8～10周龄)随机分为对照组和实验组。致死型约氏疟原虫P.y 17XL虫株为液氮保种1代原虫经复苏接种小鼠后新鲜采集的疟原虫感染红细胞(pRBC)。实验组小鼠接受P.y 17XL(1×10~4/0.1mL/只,i.v.)感染,红细胞感染率<10%时给予AS灌胃给药(25mg/kg/d),连续给药6天。感染d30,存活鼠进行P.y 17XL二次感染攻击(1×10~6/0.1mL/只,i.p.)。感染d60,对照组(P.y 17XL易感鼠)和实验组(P.y 17XL抵抗鼠)同时感染P.y 17XL(1×10~6/0.1mL/只,i.p.)。2.感染d1起制备尾静脉薄血涂片,动态监测红细胞感染率、生存率,监测体重并进行临床评分。3.感染d5取脾脏和肝脏组织制备石蜡切片,利用HE染色检测脾脏和肝脏组织病理学改变。利用F4/80免疫组织化学染色观察炎症细胞浸润情况。4.感染d5制备脾脏淋巴细胞悬液,利用流式细胞术检测CD4~+和CD8~+T细胞亚群数量及CD44、CD62L和CD127表达水平;CD4~+和CD8~+T细胞分泌效应性细胞因子IFN-γ和TNF-α的表达水平;CD8~+T细胞分泌效应分子颗粒酶素B(GB)表达水平。5.感染d5制备肝脏淋巴细胞悬液,利用流式细胞术检测CD4~+和CD8~+T细胞数量及CD127表达水平;CD4~+和CD8~+T细胞分泌效应性细胞因子IFN-γ的表达水平;CD8~+T细胞分泌效应分子GB的表达水平。6.ELISA方法定量检测血清IgM和IgG抗体水平。实验结果:1.实验组小鼠感染P.y 17XL后接受AS治疗,红细胞感染率被控制在6%左右,停药后镜下仍可见pRBC直至d15镜下无可见pRBC,小鼠存活率达90%。上述感染过程提示AS有效控制了疟原虫增殖。为观察AS治愈鼠是否对P.y17XL感染产生保护,存活鼠接受P.y17XL二次攻击(d30)。感染d5起,小鼠外周血出现pRBC,红细胞感染率<5%直至d10镜下无可见pRBC,小鼠存活率达70%。由此表明,AS治愈鼠获得了对同种疟原虫再感染的免疫保护。2.为验证AS治愈鼠对P.y 17XL感染的抵抗程度,实验组小鼠接受P.y 17XL第三次攻击(d60),与此同时,未经AS治疗的对照组小鼠接受同等剂量P.y 17XL感染。从感染d3,对照组小鼠出现活动度降低,皮毛褶皱,脚趾苍白现象。临床评分显著高于实验组。动态监测原虫血症水平结果发现,对照组红细胞感染率从d3起上升迅速,d8达峰值87.5%。当对照组小鼠红细胞感染率达峰值时,小鼠体重明显下降,尿液呈血色或深绿色,身体拱起,对外界刺激反应迟缓,小鼠从d6出现死亡,d8全部死亡。相比,实验组小鼠表现正常,镜下无可见pRBC,观察期内小鼠全部存活。由此可见对照组小鼠对P.y 17XL易感,而实验组小鼠对P.y 17XL产生抵抗。进而提示,青蒿琥酯对疟疾轻症治疗有助于宿主免疫记忆的建立与维持。3.为明确P.y17XL感染对脾脏和肝脏组织的影响,我们对两种组织进行了病理学观察。P.y17XL感染后对照组小鼠脾脏和肝脏重量显著性增加(P<0.0001,P<0.05),组织肿胀明显。组织病理学分析显示,对照组脾脏结构紊乱,脾小结消失,红白髓界限消失,疟色素沉积,组织结构破坏严重。实验组脾脏组织结构较为清晰,红白髓界限分明,红髓内有疟色素沉积。对照组肝细胞广泛肿胀,小叶内有疟色素沉积,中央静脉有大量炎性细胞浸润。实验组肝脏结构清晰,肝细胞排列紧密,可见少量疟色素颗粒。F4/80免疫组化结果显示,对照组有大量巨噬细胞浸润,而实验组炎症反应较轻。由此表明,脾脏和肝脏在P.y17XL感染中受累,AS治愈鼠肝脾组织病理损伤得到显著性缓解,这与实验组红细胞感染率得到有效控制密切相关。4.对脾脏和肝脏参与细胞免疫应答的CD4~+T细胞和CD8~+T细胞含量进行了分析。与对照组相比,实验组脾脏CD4~+T细胞和CD8~+T细胞占淋巴细胞的百分含量均显著性升高(P<0.05,P<0.01),肝脏CD4~+T细胞和CD8~+T细胞百分含量亦出现显著性增加(均P<0.05)。进一步对脾脏效应T细胞(Teff,CD44~+CD62L~-)和中枢记忆T细胞(Tcm,CD44~+CD62L~+)含量检测。与对照组相比,实验组CD4~+T细胞中Teff和Tcm含量均显著性升高(P<0.001,P<0.05)。CD8~+T细胞中Teff和Tcm含量亦明显高于对照组(P<0.05,P<0.01)。由此表明,青蒿琥酯治愈鼠脾脏和肝脏CD4~+和CD8~+T细胞均参与了抗疟保护性免疫应答。5.IFN-γ和TNF-α是细胞免疫应答重要的效应分子,在抗疟保护中发挥重要作用,为此对脾脏T细胞表达IFN-γ和TNF-α水平进行检测。与对照组相比,实验组CD3~+CD4~+IFN-γ~+T和CD3~+CD8~+IFN-γ~+T细胞含量均显著性升高(P<0.05,P<0.01)。实验组CD3~+CD8~+T细胞中IFN-γ~+细胞占51.2%,CD3~+CD4~+T细胞中IFN-γ~+细胞占8.9%,由此提示脾脏CD8~+T细胞是分泌IFN-γ的重要效应细胞。进一步对IFN-γ~+TNF-α~+T细胞水平进行了分析。与对照组相比,实验组CD3~+CD4~+IFN-γ~+TNF-α~+T细胞和CD3~+CD8~+IFN-γ~+TNF-α~+T细胞含量均显著性升高(均P<0.01)。实验组CD3~+CD8~+T细胞中IFN-γ~+TNF-α~+细胞占24.5%,CD3~+CD4~+T细胞中IFN-γ~+TNF-α~+细胞占5.7%。由此表明,青蒿琥酯治愈鼠通过Th1和Tc1(Th1样CD8~+T细胞)型细胞亚群以分泌IFN-γ和TNF-α方式介导抗疟免疫保护。6.为分析效应或效应记忆T细胞亚群在产生IFN-γ中的差异,对IFN-γ~+T细胞表达CD127水平进行分析。与对照组IFN-γ~+效应记忆T细胞相比,脾脏CD4~+IFN-γ~+CD127~+T细胞和CD8~+IFN-γ~+CD127~+T细胞含量均显著性增加(P均<0.05),肝脏CD8~+IFN-γ~+CD127~+T细胞含量显著性增加(P<0.05)。由此提示,效应记忆T细胞是IFN-γ重要的细胞来源。进一步对IFN-γ~+效应T细胞分析发现,实验组脾脏和肝脏CD4~+IFN-γ~+CD127~-效应T细胞占CD4~+T细胞比例与对照组无显著差异,相比,CD8~+IFN-γ~+CD127~-效应T细胞含量显著性增加(P均<0.01)。实验组IFN-γ~+总细胞数分析显示,分泌IFN-γ的CD8~+T细胞总数在脾脏(P<0.05)和肝脏(P<0.01)均显著性高于CD4~+T细胞。进一步强化了CD8~+T细胞免疫调节效应在抗疟免疫应答中的作用。7.颗粒酶B(granzyme B,GB)是CTL细胞发挥细胞毒性作用的效应分子,为此对脾脏和肝脏CD3~+CD8~+T细胞分泌GB水平进行分析。流式结果显示,与对照组相比,实验组脾脏CD3~+CD8~+T细胞几乎不表达GB,CD3~+CD8~+GB~+T细胞百分含量和绝对值均显著性降低(P<0.001,P<0.05)。相比,实验组和对照组肝脏CD3~+CD8~+T细胞均可分泌GB,且两组间CD3~+CD8~+GB~+T细胞数量无显著性差异。上述结果表明,青蒿琥酯治愈鼠细胞毒性效应分子GB主要来自肝脏而非脾脏的CTL细胞。由此进一步强化了肝脏在清除pRBC中的重要作用。8.辅助体液免疫应答是细胞免疫应答的重要作用。为此,我们对两组小鼠血清疟原虫特异性抗体水平进行了检测。根据标准品结果,绘制了IgM标准曲线log(y)=0.162×log(x)-0.341(R~2=0.951)和IgG标准曲线log(y)=0.326×log(x)-0.088(R~2=0.944)。对照组和实验组血清IgM水平无显著性差异,但实验组3感比2感IgM水平升高明显(P<0.05)。与对照组相比,AS治愈鼠2感和3感血清IgG水平均显著性升高(均P<0.001),且3感比2感升高更为明显(P<0.05)。由此表明,AS治愈鼠体抵抗P.y 17XL感染的抗体应答水平显著性提高。结论:1.低密度原虫感染配合青蒿琥酯治疗有助于BALB/c小鼠获得对P.y17XL再感染的免疫保护。2.CD4~+T细胞和CD8~+T细胞介导的细胞免疫在青蒿琥酯治愈鼠抵抗P.y 17XL再感染中发挥重要作用;3.脾脏和肝脏T细胞来源的IFN-γ和TNF-α,CTL分泌的GB和血清特异性IgG抗体是抵抗P.y 17XL感染的重要效应分子。