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艰难梭菌(Clostridium difficile)为革兰氏阳性厌氧芽孢梭菌,广泛存在于自然环境及人类和动物粪便中,是人体肠道中的正常菌群。由于广泛应用广谱抗生素、免疫抑制剂或化疗药物等药物,人体肠道微生物菌群平衡被扰乱,艰难梭菌大量繁殖,引发艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection,CDI),导致严重腹泻和肠道炎症,甚至死亡。现阶段,艰难梭菌引起的腹泻和假膜性结肠炎的发病率和死亡率在世界范围内呈上升趋势,使得治疗和控制艰难梭菌感染面临严峻的挑战。已有研究表明,CDI主要致病因子是艰难梭菌分泌的两种外毒素TcdA(308 kDa)和TcdB(269 kDa)。TcdA和TcdB是多结构域蛋白,均包含4个功能结构区:葡萄糖基转移酶区(Glucosyltransferase domain,GTD)、半胱氨酸水解酶区(Cysteine proteinase domain,CPD)、跨膜区(Transmembrane domain,TMD)以及受体结合区(Receptor binding domain,RBD),其主要通过糖基化宿主细胞内的Rho GTPase引起细胞的中毒反应。其中TcdB的细胞毒性比TcdA强1000倍;但在多种动物模型中,TcdA能够引起严重的组织损伤和肠积水等肠毒性,而TcdB却不表现肠毒性。为何Tcd B没有肠毒性,其原因是否与TcdB的机构有关?因此本课题将重点研究艰难梭菌毒素TcdB的肠毒性与结构功能之间的关系。本文重点关注艰难梭菌毒素肠毒性与结构功能之间的关系,研究内容如下:1.艰难梭菌毒素肠毒性研究;2.对艰难梭菌毒素致病机理研究。第一部分,我们实验室在前期研究艰难梭菌毒素TcdB结构和功能的基础上构建了两种突变毒素:TcdB-D97(TD区域97个氨基酸敲除)和TcdB-L543A(LA)(CPD区域的点突变),然后以突变毒素TcdB-D97和LA为基础研究TcdB与肠毒性的关系。将突变毒素注射到小鼠回肠节内,对肠道积水进行定量分析,检测炎症因子的分泌、中性粒细胞浸润及肠上皮组织损伤。结果表明,这两种突变毒素均可引起小鼠回肠节肿胀,具有肠毒性。然后我们对这两种突变毒素进行了GTD释放效率、葡萄糖基转移酶活性、以及GTD进入细胞质情况等一系列检测。实验结果表明,艰难梭菌毒素引起的肠炎症可能是由于毒素的GTD结构域不能正常进入肠上皮细胞的细胞质中,从而引发炎症。第二部分,我们在实验中引入了一种小分子抑制剂TUDCA(Tauroursodeoxycholic Acid),它可抑制Rac1蛋白的葡萄糖基化而诱导Rac1蛋白的磷酸化,将TUDCA和艰难梭菌毒素TcdB混合后注射到小鼠回肠节内诱导小鼠严重的肠积水和炎症反应,证实了肠上皮细胞内Rac1的糖基化被抑制而诱导产生的磷酸化导致小鼠回肠积水,从而引起急性炎症反应。另外,突变毒素aTcd B-D97的实验结果也证实细胞Rac1磷酸化可能是艰难梭菌毒素引起肠炎症的必要条件之一,与GTD功能的完整与否无关。同时也发现TUDCA可以和艰难梭菌毒素TcdB跨膜区1756-1780这25个氨基酸结合,从而抑制了TUDCA的Rac1磷酸化的能力;当Tcd B、TUDCA和外源合成跨膜区AA1752-1784这33个氨基酸组成的多肽混合注射到小鼠回肠节内,回肠积水显著减少,急性炎症反应也明显减轻。高迁移率组蛋白B1(high-mobility group box 1,HMGB1)是HMGB家族成员,主要存在于细胞核内,HMGB1作为重要的炎症因子,可以分泌到细胞外与靶细胞膜表面的受体结合并通过介导的信号传导通路激活炎症反应以及免疫反应。本文采用小鼠回肠结扎模型为基础,研究了HMGB1在艰难梭菌毒素TcdA诱导的急性肠炎症中的作用。我们采用可以中和HMGB1活性的抑制剂—甘草酸钠抑制了小鼠肠道细胞中HMGB1的活性,结果发现小鼠肠肿胀症状明显改善,TcdA引起的急性肠炎症也明显好转;同时发现添加外源性HMGB1可诱导强烈的肠炎症反应,因此可得出以下结论:炎症因子HMGB1参与了TcdA引起的急性肠炎症反应。综上所述,本研究通过多种分子生物学、细胞生物学、病理学方法和动物实验结合,研究艰难梭菌毒素的结构域功能,并初步探讨艰难梭菌毒素在急性肠炎症中的作用机理。在对重组艰难梭菌全毒素以及其各种突变毒素的研究中,我们可以得到以下结论:1.在动物模型小鼠回肠结扎实验中,本无肠毒性的艰难梭菌毒素TcdB与TUDCA共同注射时具有肠毒性;2.艰难梭菌毒素葡萄糖基转移酶活性区GTD能否进入细胞质,决定艰难梭菌毒素是否具有肠毒性;3.细胞膜表面Rac1的磷酸化是艰难梭菌毒素诱导肠炎症的必要条件之一;4.艰难梭菌毒素GTD的葡萄糖基转移酶活性有无与毒素的肠毒性无关;5.艰难梭菌毒素TcdB跨膜区1756-1780 25个氨基酸可以和TUDCA结合并阻止GTD进入细胞质,被认为可能与TcdB肠毒性缺失有关。本文以表达和突变艰难梭菌毒素为基础,重点研究了艰难梭菌毒素结构域和肠毒性之间的关系,构建和表达了GTD活性区不能进入细胞质的突变毒素TcdB-D97、LA、aTcdB-D25,并且对他们的肠毒性进行了研究,探讨了艰难梭菌毒素的致病机理;同时,本文还研究了炎症因子HMGB1在肠炎症中的作用。本研究在艰难梭菌毒素的肠毒性机制上有了新发现,填补了人们对于艰难梭菌致病机理的一些知识空白,并且为进一步了解艰难梭菌感染和疾病治疗模型提供了理论基础。