实验一补肾养血活血法经PI3K/AKT/mTOR信号通路促卵泡发育修复卵巢损伤的实验研究目的:观察补肾养血活血中药复方新加苁蓉菟丝子丸（XJCRTSZW）经PI3K/AKT/mTOR信号通路促卵泡发育修复卵巢损伤的药物疗效。方法:1、从购进的100只健康雌性SD大鼠中筛选出动情周期正常的56只大鼠作为受试动物,随机抽取8只为正常对照组予蒸馏水灌胃,其余48只按照预实验结果,予雷公藤甲素（triptolide,TP）400μg/kg.d的剂量连续灌胃60d构建卵泡发育障碍模型。2、造模后大鼠随机分为6组,每组8只:Triptolide模型组、西药戊酸雌二醇+醋酸甲羟孕酮（EV+DMPA）组、XJCRTSZW低剂量组、XJCRTSZW高剂量组,抑制剂（NVP-BEZ235）组,XJCRTSZW高剂量+抑制剂（NVP-BEZ235）组。西药对照组给予戊酸雌二醇和醋酸甲羟孕酮序贯治疗;中药低、高剂量组分别给予新加苁蓉菟丝子丸低、高剂量浸膏治疗;抑制剂组予NVP-BEZ235灌胃;XJCRTSZW高剂量+抑制剂（NVP-BEZ235）组给予高剂量中药及NVP-BEZ235灌胃;正常对照组和TP模型组给予等量的蒸馏水灌胃。所有动物均灌胃2周,灌胃期间行阴道脱落细胞涂片检查观察大鼠动情周期变化。3、灌胃结束后采血,ELISA法检测血清E₂、P、FSH、LH、AMH、ET水平,硝酸还原酶法检测NO水平并计算ET/NO比值;采血后处死大鼠,摘取双侧卵巢组织,称取卵巢湿重,计算卵巢指数;卵巢切片HE染色,光学显微镜下计数初级、次级卵泡、窦状卵泡、闭锁卵泡及黄体的数目,并测量窦状卵泡颗粒细胞层厚度;采用WB法检测卵巢组织中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的蛋白含量。结果:1、新加苁蓉菟丝子丸对大鼠血清性激素的影响:与正常对照组相比,TP模型组大鼠血清中E₂、P、AMH含量显著下降,FSH、LH含量显著增加（p<0.01）;而和模型组相比,XJCRTSZW给药后可增加E₂、P、AMH含量,降低FSH、LH含量（p<0.01）,且XJCRTSZW高剂量组和西药组效果相当（p>0.05）,而使用通路抑制剂NVP-BEZ235后,XJCRTSZW高剂量组升高E₂、P、AMH及降低FSH、LH的能力消失（p<0.01）。2、新加苁蓉菟丝子丸对大鼠血清中ET、NO及ET/NO的影响:与正常对照组相比,TP模型组大鼠血清中ET含量上升,NO含量下降,ET/NO比值显著升高（p<0.01）;而和TP模型组相比,XJCRTSZW给药后可增加NO含量,降低ET含量以及ET/NO比值（p<0.01）,且XJCRTSZW高剂量组与西药组效果相当（p>0.05）。而使用PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂NVP-BEZ235后,大鼠卵巢中NO含量所下降,ET含量及ET/NO值有所升高,但无统计学意义（p>0.05）,XJCRTSZW高剂量组对卵巢的保护能力出现了一定程度的消失。3、新加苁蓉菟丝子丸对大鼠卵巢湿重、卵巢指数的影响:与正常对照组相比,TP模型组大鼠卵巢湿重和卵巢指数显著下降（p<0.01）;而和TP模型组相比,XJCRTSZW给药后可一定程度上增加大鼠卵巢湿重和卵巢指数（p<0.01）,且XJCRTSZW高剂量组和西药组效果相当（p>0.05）。而使用PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂NVP-BEZ235后,XJCRTSZW高剂量组提升卵巢湿重和卵巢指数的能力消失（p<0.01）。4、新加苁蓉菟丝子丸对大鼠卵泡发育、黄体数及窦状卵泡颗粒细胞层厚度的影响:与正常对照组相比,TP模型组大鼠次级卵泡及窦状卵泡数量减少,黄体数和窦状卵泡颗粒细胞层的厚度降低（p<0.01）,闭锁卵泡数量上升（p<0.01）,而对初级卵泡数目无明显影响（p>0.05）;与TP模型组相比,XJCRTSZW给药后可一定程度上增加大鼠次级卵泡和窦状卵泡数,增加黄体数和窦状卵泡颗粒细胞层的厚度（p<0.01）,减少闭锁卵泡数（p<0.01）,且XJCRTSZW高剂量组和西药组效果相当（p>0.05）。而使用PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂NVP-BEZ235后,XJCRTSZW高剂量组的对卵泡发育的保护能力消失（p<0.01）。5、新加苁蓉菟丝子丸对大鼠卵巢组织中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的影响:与正常对照组相比,TP模型组大鼠卵巢组织中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的蛋白水平显著下降（p<0.05或p<0.01）,XJCRTSZW高剂量组可不同程度改善TP造模后对上述分子的影响（p<0.05或p<0.01）,而使用通路抑制剂NVP-BEZ235后,XJCRTSZW高剂量组上调上述分子的能力消失（p<0.05或p<0.01）。结论:雷公藤甲素400μg/kg.d连续灌胃60天,可成功构建大鼠卵泡发育障碍的在体动物模型,其分子机制可能是雷公藤甲素通过下调PI3K/AKT/mTOR信号通路中的关键蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR而对该通路进行了抑制。补肾养血活血中药复方新加苁蓉菟丝子丸可通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路改善大鼠的性激素水平,增加大鼠的卵巢湿重和卵巢指数,恢复大鼠的各级卵泡数、黄体数及生长卵泡的颗粒细胞层厚度,改善大鼠的“血瘀”状态,保护大鼠的卵泡发育,修复TP所致的卵巢损伤。实验二补肾养血活血法经PI3K/AKT/mTOR信号通路调控卵巢颗粒细胞凋亡及自噬流促卵泡发育的分子机制目的:探讨补肾养血活血中药复方新加苁蓉菟丝子丸经PI3K/AKT/mTOR信号通路调控大鼠卵巢颗粒细胞（GCs）凋亡及自噬流促卵泡发育的分子机制。方法:1、将体外培养的原代大鼠卵巢GCs分为9组:正常对照组、TP模型组、西药FSH组、XJCRTSZW低高剂量组、自噬诱导剂组、XJCRTSZW高剂量+自噬诱导剂组、凋亡诱导剂组、XJCRTSZW高剂量+凋亡诱导剂组。正常对照组给予蒸馏水灌胃的大鼠血清,其余8组先加TP诱导12h后,模型组给予蒸馏水灌胃的大鼠血清,西药FSH组加入含FSH大鼠血清,中药低、高剂量组分别加入相应剂量的大鼠含药血清,自噬、凋亡诱导剂组分别加入蒸馏水灌胃的大鼠血清及自噬、凋亡诱导剂,XJCRTSZW高剂量+自噬诱导剂组加入XJCRTSZW高剂量血清和自噬诱导剂RAPA,XJCRTSZW高剂量+凋亡诱导剂组加入XJCRTSZW高剂量血清和凋亡诱导剂CPT。2、上述药物及相应大鼠血清孵育48小时后做如下检测。CCK8法检测细胞活力,流式细胞术检测各组GCs的凋亡率,ELISA法检测细胞培养上清中E₂、P和AMH水平,mRFP-GFP-LC3腺病毒转染后激光共聚焦显微镜下观察自噬流并计数自噬小体、自噬溶酶体数目,透射电子显微镜下观察各组GCs中的自噬小体及自噬溶酶体形成,WB及RT-qPCR法检测Caspase-3、Cleaved Casepase-3、LC3-II、LC3-I、Beclin-1、p62、LAMP2、Cathepsin-D及PI3K/AKT/mTOR信号通路轴相关分子的蛋白表达及mRNA水平,并计算LC3-II/LC3-I的比值。结果:1、新加苁蓉菟丝子丸对颗粒细胞增殖、凋亡的影响:（1）细胞活力检测:TP造模后,卵巢GCs的细胞活力显著下降（p<0.01）,说明TP对GCs的增殖存在明显抑制。XJCRTSZW高剂量血清组可显著提升GCs活力（p<0.05）。而加用CPT处理细胞后,XJCRTSZW高剂量血清组保护细胞活力的能力出现了明显消失（p<0.05或p<0.01）。说明XJCRTSZW正是通过抑制GCs的凋亡提升了细胞活力,促进了细胞增殖。（2）WB:TP造模后,凋亡相关分子Cleaved Caspase-3（CC3）蛋白表达显著上调（p<0.01）,但对Casepase-3无明显影响,XJCRTSZW高剂量组可明显改善TP造模后对CC3的影响（p<0.01）,而使用CPT后,XJCRTSZW高剂量组下调CC3蛋白表达的能力消失,说明中药通过下调凋亡因子CC3保护了GCs的增殖。（3）流式细胞术:TP造模后GCs凋亡率高达39.54%（仅次于加用了凋亡诱导剂的CPT组）,TP造模后,凋亡率显著上升（p<0.01）。XJCRTSZW高、低剂量组干预后,大鼠GCs凋亡率显著下降（p<0.01）,且XJCRTSZW高剂量组下降最为明显（凋亡率12.67%）,与西药FSH组效果无差异（p>0.05）。加用凋亡诱导剂CPT后,XJCRTSZW高剂量血清组降低细胞凋亡率、抑制细胞凋亡的能力消失（p<0.01）。2、新加苁蓉菟丝子丸对颗粒细胞自噬流的影响:（1）WB法和RT-qPCR法:TP造模后,自噬流相关分子LC3Ⅱ、Beclin1、LAMP2、Cathepsin-D的蛋白表达及mRNA水平显著上调,LC3-II/LC3-I比值上升（p<0.05或p<0.01）,p62的蛋白表达及mRNA水平显著下调（p<0.01）;XJCRTSZW高剂量组可显著下调LC3Ⅱ、Beclin1、LAMP2、Cathepsin-D的蛋白表达及mRNA水平（p<0.05或p<0.01）,上调p62的蛋白表达及mRNA水平（p<0.01）。而使用自噬诱导剂RAPA后,XJCRTSZW高剂量组保护GCs的能力消失。（2）电镜:和正常对照组相比,TP模型组大鼠卵巢GCs中自噬小体以及自噬溶酶体数量增加;和TP模型组相比,XJCRTSZW血清组大鼠卵巢颗粒细胞中自噬小体以及自噬溶酶体数量减少;而加用RAPA处理细胞后,XJCRTSZW高剂量组抑制自噬小体以及自噬溶酶体产生的能力下降。（3）mRFP-GFP-LC3腺病毒转染:TP造模后,大鼠卵巢GCs中自噬小体（黄色斑点）以及自噬溶酶体（红色斑点）数量显著增加（p<0.01）;和TP模型组相比,XJCRTSZW高、低剂量组大鼠卵巢颗粒细胞中自噬小体以及自噬溶酶体数量显著减少（p<0.01）,且XJCRTSZW高剂量组与西药FSH组无差异（p>0.05）。在加用自噬诱导剂RAPA处理细胞后,XJCRTSZW高剂量组抑制自噬小体以及自噬溶酶体产生的能力显著下降（p<0.01）。3、新加苁蓉菟丝子丸对大鼠卵巢颗粒细胞上清中E₂、P、AMH分泌的影响:与正常对照组相比,TP模型组大鼠卵巢颗粒细胞上清中E₂、P和AMH的含量显著下降（p<0.01）;和模型组相比,XJCRTSZW高剂量组大鼠卵巢GCs上清中E₂、P和AMH的含量显著升高（p<0.01或p<0.05）,且XJCRTSZW高剂量组与FSH组效果相当（p>0.05）;在加用RAPA和CPT处理细胞后,XJCRTSZW高剂量组对E₂、P、AMH含量的上调作用出现了一定程度的消失,但无统计学意义（p>0.05）。4、新加苁蓉菟丝子丸对大鼠卵巢颗粒细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路轴相关分子的影响:通过WB检测我们发现,TP造模后,PI3K/AKT/mTOR通路轴相关蛋白PI3K、AKT、mTOR的磷酸化水平显著下降（p<0.05或p<0.01）;XJCRTSZW高剂量组可明显改善TP造模后对上述分子的影响（p<0.05或p<0.01）;而使用RAPA及CPT后,XJCRTSZW高剂量组的治疗能力消失（p<0.05或p<0.01）。结论:雷公藤甲素可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路一方面增加GCs凋亡率、上调凋亡相关分子Cleaved Caspase-3促进了GCs凋亡,另一方面增加GCs自噬小体和自噬溶酶体的数量,上调自噬相关因子LC3Ⅱ、Beclin1、LAMP2、Cathepsin-D并下调p62激活了GCs自噬流,从而损伤了大鼠卵巢GCs,抑制了卵泡发育。补肾养血活血中药复方新加苁蓉菟丝子丸可能通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路一方面降低GCs凋亡率、下调凋亡相关分子Cleaved Caspase-3抑制了GCs凋亡,另一方面减少GCs自噬小体和自噬溶酶体的数量,下调自噬相关因子LC3Ⅱ、Beclin1、LAMP2、Cathepsin-D并上调p62抑制了GCs自噬流的过度活化,从而修复了TP所致的大鼠卵巢GCs损伤,保护了大鼠卵泡发育,为卵泡发育障碍类疾病提供了防治新靶点,为雷公藤导致的卵巢损伤提供了新的可能的修复方案。