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褐飞虱Nilaparvata lugens(St?l)是亚洲主要的水稻害虫,其在刺吸取食水稻过程中分泌唾液参与植物互作。目前对褐飞虱唾液蛋白的鉴定及功能研究较少。在本研究中,采用蔗糖溶液喂食法收集褐飞虱唾液,利用Shotgun LC-MS/MS质谱技术对褐飞虱唾液蛋白进行鉴定,并选取了钙离子结合蛋白进行分子特性的研究,以期进一步分析其在植虫互作中的功能。(1)褐飞虱唾液蛋白的功能鉴定:在收集的褐飞虱唾液中共鉴定出107种蛋白质,其中80%蛋白成功注释。使用Blast2GO进行功能注释时,发现其中29个蛋白质具有催化活性,24个蛋白质具有结合活性。鉴定的唾液酶类包括氧化还原酶、水解酶、磷酸酶、肽酶(蛋白酶)、激酶、转移酶和裂解酶等;鉴定的结合蛋白包括ATP结合蛋白、载脂蛋白、钙离子结合蛋白、肌动蛋白结合蛋白、DNA结合蛋白、RNA结合蛋白和染色质结合蛋白等。还鉴定了其他蛋白,如泛素、热休克蛋白、核糖体蛋白和免疫球蛋白等。对褐飞虱唾液蛋白进行定性分析,能够为褐飞虱-水稻的互作研究提供基础。(2)NlCBP1、NlCBP2蛋白的功能分析:有研究表明钙离子结合蛋白在蚜虫等刺吸式昆虫与植物互作中起着重要的作用,因此本文中在褐飞虱唾液蛋白组和唾液腺转录组中,选取了八个钙离子结合蛋白进行分子特性研究。首先通过荧光定量PCR比较分析了这八个蛋白在褐飞虱头部、中肠、卵巢、唾液腺等组织中的相对表达水平,发现具有EF-hand结构域的两个蛋白NlCBP1和NlCBP2在褐飞虱唾液腺高度表达,使用原位杂交技术进一步验证了NlCBP1和NlCBP2在褐飞虱唾液腺中有表达。NlCBP1是褐飞虱唾液蛋白组中发现的蛋白;通过免疫抗体和Western blot技术在褐飞虱取食后的水稻植株中检测到NlCBP2蛋白,证明NlCBP2也是褐飞虱的唾液蛋白。为了更深入的探究褐飞虱唾液蛋白NlCBP1和NlCBP2的功能,合成了这两个蛋白基因的dsRNA,并对三龄褐飞虱进行注射,发现干扰目的基因3天后,褐飞虱的死亡率与对照相比显著提高,干扰7-8天后,褐飞虱的死亡率与对照相比有极显著差异。采用刺探电位图谱(EPG)监测到NlCBP1和NlCBP2被干扰后的褐飞虱成虫取食到水稻韧皮部的时间占总取食时间之比明显降低。这些结果表明NlCBP1和NlCBP2对褐飞虱的存活及取食非常重要。本文鉴定了褐飞虱唾液蛋白并分析了唾液中两个钙离子结合蛋白的基因特性,为进一步研究褐飞虱唾液蛋白的功能做了抛砖引玉的工作,也为以后研究褐飞虱-水稻互作奠定了基础。