研究目的:　　构建梅毒螺旋体(Treponema pallidum, Tp)重组蛋白FlaA、TpN17、TpN47的原核表达载体，在大肠杆菌中进行诱导表达，研究FlaA(TP0249)、TpN17(TP0435)、TpN47(Tp0574)在梅毒临床血清学诊断中应用，探索重组蛋白FlaA在刺激THP-1细胞（即人急性单核细胞白血病细胞）产生促炎症因子（proinflammatory cytokines）TNF-α、IL-6方面的作用，探索FlaA、TpN17、TpN47在梅毒临床血清学诊断中的应用价值，与TpN17、TpN47已有研究成果相结合，为完善和补充现有研究成果，及进一步研究梅毒的致病机制和相关疫苗提供实验依据。　　研究方法:　　从GenBank获取FlaA、TpN17、TpN47的基因序列，通过生物信息学分析，去除FlaA、TpN17、TpN47信号肽序列，以TP Nichols标准株基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因片段，将目的基因片段分别插入到表达载体PET-28a中，构建重组质粒PET-28a-FlaA、PET-28a-TpN17、PET-28a-TpN47，导入表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中，从含有PET-28a-FlaA、PET-28a-TpN17、PET-28a-TpN47的大肠杆菌BL21(DE3)提取质粒，使用PCR及双酶切鉴定，IPTG诱导重组蛋白表达，SDS-PAGE鉴定重组蛋白、确定重组蛋白表达形式，Western blot鉴定重组蛋白，确定重组蛋白FlaA、TpN47、TpN17最佳诱导温度，确定诱导重组蛋白FlaA、TpN47、TpN17表达的最适IPTG浓度，洗涤包涵体纯化重组蛋白FlaA、TpN47、TpN17，BCA法测定重组蛋白FlaA、TpN47、TpN17的浓度。对重组蛋白FlaA进行透析复性并测定复性的重组蛋白FlaA的浓度。　　为了探索重组蛋白FlaA能否诱导THP-1细胞产生促炎症因子（proinflammatory cytokines）IL-6、TNF-α，以重组蛋白FlaA、阳性对照LPS、阴性对照PBS刺激THP-1细胞，同时加入多粘菌素B(Polymyxin B，PMB)抑制内毒素，流式细胞术检测IL-6、TNF-α。　　为了评价梅毒螺旋体重组蛋白FlaA、TpN17、TpN47在梅毒血清学诊断中的应用价值，分别使用重组蛋白FlaA、TpN17、TpN47为抗原蛋白，以待血清标本为一抗，以辣根过氧化物酶标记山羊抗人IgG(H+L)为二抗，进行Western blot试验，优化各重组蛋白的上样量、血清浓度、二抗浓度，将重组蛋白FlaA、TpN17、TpN47以优化后的Western blot试验条件分别检测临床收集的160份TPPA阳性梅毒血清、30份TPPA阴性的易发生交叉反应（怀孕、自身免疫性疾病）的血清及30份TPPA阴性且无交叉反应因素的非梅毒血清，初步评价梅毒螺旋体重组蛋白FlaA、TpN17、TpN47在梅毒血清学诊断中的应用价值。　　研究结果:　　PCR扩增得到402bp(TpN17)、990bp(FlaA)、1275bp(TpN47)的目的片段，重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定和DNA测序，证明重组质粒PET-28a-FlaA、 PET-28a-TpN17、PET-28a-TpN47中插入的是FlaA、TpN17、TpN47目的基因，测序结果与GenBank上登陆序列完全一致; SDS-PAGE和Western blot结果显示，含有重组质粒PET-28a-FlaA、PET-28a-TpN17、PET-28a-TpN47的表达宿主菌在IPTG诱导下分别表达了相对分子质量约为37kDa、17kDa、47kDa的重组蛋白，重组蛋白TpN17、重组蛋白FlaA、重组蛋白TpN47在菌体细胞内主要以包涵体的形式存在，经包涵体洗液洗涤后得到了纯度较高的重组蛋白TpN17、重组蛋白FlaA、重组蛋白TpN47;透析复性重组蛋白FlaA得到了可溶性的重组蛋白FlaA。　　重组蛋白FlaA在0.5μg/mL-100μg/mL浓度范围内无法诱导THP-1细胞产生IL-6、TNF-α，同组阳性对照LPS100ng/mL可以诱导THP-1细胞产生IL-6、TNF-α。　　以重组蛋白FlaA、TpN17、TpN47为抗原，通过Western blot检测TPPA阳性梅毒血清、TPPA阴性的易发生交叉反应的非梅毒血清及TPPA阴性且无交叉反应因素的非梅毒血清共220份，有16例假阴性结果，无假阳性结果。显示重组蛋白FlaA、TpN17、TpN47联合Western blot检测梅毒具有较好的敏感度和特异度。　　通过分析FlaA对重组蛋白联合Western blot检测结果的影响，证明FlaA、TpN17、TpN47三者联合应用与TpN17、TpN47两者联合应用的差异有极显著意义，可知FlaA的存在极大的提高了重组蛋白联合Western blot检测的敏感度。通过分析TpN47单独应用和TpN17、TpN47两者联合应用的差异，显示出TpN17和TpN47良好的互补效果。实验结果证明，在FlaA、TpN17、TpN47联合Western blot检测中，三种蛋白选用合理，发挥了各自的作用。　　研究结论:　　1.成功构建了PET-28a-FlaA、PET-28a-TpN17、PET-28a-TpN47原核表达载体，并在表达宿主菌大肠杆菌BL-21(DE3)中成功表达。　　2.重组蛋白FlaA不能刺激THP-1细胞产生促炎症因子IL-6、TNF-α，已知FlaA可引起强烈的Th1型免疫反应，在梅毒病原体的清除和抵抗再感染中发挥重要作用，提示FlaA可以用于诱导细胞免疫反应制备疫苗。　　3.重组蛋白FlaA、TpN17、TpN47联合Western blot检测梅毒具有较好的敏感度和特异度;FlaA的存在，极大的提高了重组蛋白联合Western blot检测的敏感度，显示出重组蛋白FlaA在临床诊断方面较高的应用价值;TpN47和TpN17在梅毒检测中有互补的效果，FlaA、TpN17、TpN47联合Western blot检测中三种蛋白选用合理，发挥了各自的作用。为梅毒诊断寻找新的未知蛋白靶点提供了实验依据。