第一部分 骨肉瘤lncRNA表达谱分析和LncRNA-SNHG14在骨肉瘤中的表达及临床意义目的:利用lncRNA微阵列芯片技术,分析骨肉瘤lncRNA的表达谱,筛选出关键lncRNA并在骨肉瘤组织和细胞中进行验证,分析关键lncRNA的临床意义。方法:收集46对骨肉瘤组织和对应癌旁组织,随机选择其中6对进行lncRNA微阵列芯片检测,按照差异倍数>2.0且p值<0.05筛选出差异表达的lncRNA,并选择差异最明显的lncRNA作为候选研究对象。通过qRT-PCR检测目标lncRNA在骨肉瘤组织中的表达水平以及其表达水平与骨肉瘤临床特征及预后的关系。结果:通过对6对骨肉瘤和癌旁组织的lncRNA微阵列芯片检测,共筛选出62个差异表达的lncRNA,其中39个lncRNA在骨肉瘤组织中表达上调,23个lncRNA表达下调,LncRNA-SNHG14是其中差异倍数最大者。接下来在46对组织中的验证证实lncRNA-SNHG14在骨肉瘤组织中的水平显著高于其在癌旁组织中的表达水平。按照肿瘤化疗敏感性、远处转移与否、术后生存情况等对46例骨肉瘤组织进行分组,发现lncRNA-SNHG14的高表达水平与骨肉瘤的化疗不敏感、远处转移密切相关,并且高表达的SNHG14导致了骨肉瘤患者较差的术后总生存率及无复发生存率。结论:本部分实验结果描绘了骨肉瘤lncRNA表达谱,筛选出潜在的关键分子lncRNA-SNHG14。证实了 lncRNA-SNHG14与骨肉瘤重要癌性特征间的密切关系,为下一步lncRNA-SHNG14的功能探索打下基础。第二部分 LncRNA-SNHG14对骨肉瘤细胞增殖、侵袭及化疗敏感性的影响目的:在第一部分结果的基础上,从细胞层面出发,探索lncRNA-SNHG14对骨肉瘤细胞增殖、侵袭和化疗敏感性的影响,进一步明确lncRNA-SNHG14的分子功能。方法:构建lncRNA-SNHG14敲减质粒和过表达质粒,通过筛选稳定转染细胞株获得lncRNA-SNHG14沉默和过表达的骨肉瘤细胞。CCK-8实验、集落形成实验和EdU实验用来验证lncRNA-SNHG14对骨肉瘤细胞增殖能力的影响。进行划痕愈合实验和transwell侵袭实验来确定细胞内lncRNA-SNHG14表达水平对细胞迁移和侵袭性的影响。利用流式细胞术并绘制IC50曲线观察lncRNA-SNHG14的水平是否影响骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性。利用蛋白免疫印迹实验检测lncRNA-SNHG14对上皮-间质转化相关因子和凋亡相关蛋白表达水平的影响。此外,构建裸鼠皮下荷瘤模型,观察lncRNA-SNHG14沉默对动物体内骨肉瘤生长的抑制作用。结果:qRT-PCR确定lncRNA-SNHG14的敲低和过表达是有效的。CCK-8实验、集落形成实验和EdU实验的结果显示lncRNA-SNHG14沉默后细胞的增殖能力显著下降。通过划痕愈合实验和transwell侵袭实验我们发现lncRNA-SNHG14敲低后细胞的迁移和侵袭性明显减弱,蛋白免疫实验证实lncRNA-SNHG14的下调抑制了上皮-间质转化过程。流式细胞术和IC50曲线的结果说明抑制细胞内lncRNA-SNHG14的表达可以增强顺铂对骨肉瘤细胞的杀伤作用且半数抑制浓度明显下降,蛋白免疫印迹证实lncRNA-SNHG14沉默后促凋亡蛋白表达增高,抗凋亡蛋白表达下降。裸鼠荷瘤模型得到了与体外实验相似的结果,即下调细胞内lncRNA-SNHG14的表达水平抑制了体内瘤体的形成和生长。对于过表达lncRNA-SNHG14的细胞,我们得到了相反的结果,即lncRNA-SNHG14的上调促进了骨肉瘤细胞的增殖和侵袭能力,并增强了细胞对顺铂的抵抗性。结论:本部分实验结果了lncRNA-SNHG14对骨肉瘤细胞增殖、侵袭和化疗敏感性的影响,进一步明确了 lncRNA-SNHG14在骨肉瘤中扮演的致癌基因角色。第三部分 LncRNA-SNHG14促进骨肉瘤进展的分子机制探索目的:从前两部分的研究结果我们可知lncRNA-SNHG14在骨肉瘤细胞中扮演促癌基因的角色,但其介导的具体分子机制尚不清楚。因此,本部分研究着重探讨了lncRNA-SNHG14在骨肉瘤细胞中潜在的分子机制。方法:首先通过在线数据库预测lncRNA-SNHG14的亚细胞定位,然后利用荧光原位杂交和核质分离RNA的PCR技术进行验证。接着检测CADM1在46对骨肉瘤组织和癌旁组织中的表达,分析其与lncRNA-SNHG14表达水平间的关系。确定相关性后,利用BLAST序列比对和双荧光素酶报告基因确定lncRNA-SNHG14和CADM1启动子间的结合作用。之后利用甲基化特异性PCR和亚硫酸盐测序技术检测CADM1启动子区的甲基化水平以及lncRNA-SNHG14沉默对CADM1启动子甲基化的影响。此外,进行染色质免疫共沉淀和RNA免疫共沉淀验证甲基转移酶DNMT1与CADM1启动子和lncRNA-SNHG14的结合。利用qRT-PCR和蛋白免疫印迹实验观察lncRNA-SNHG14对CADM1的表达调控和对CADM1下游STAT3的活性影响。最后进行挽救实验确定CADM1介导了lncRNA-SNHG14对骨肉瘤细胞增殖、侵袭和顺铂敏感性的影响。结果:首先通过荧光原位杂交和核质分离PCR我们发现lncRNA-SNHG14定位于细胞核中。CADM1在骨肉瘤组织中的表达显著低于其在癌旁组织中的表达水平,且与lncRNA-SNHG14在骨肉瘤中表达呈负相关关系。双荧光素酶报告基因的结果证实了lncRNA-SNHG14与CADM1的启动子区存在结合关系。甲基化特异性PCR和亚硫酸亚测序的结果提示我们在骨肉瘤细胞中CADM1的启动子高甲基化,并且沉默lncRNA-SNHG14后其甲基化修饰基本消失。进一步的染色质免疫共沉淀和RNA免疫共沉淀证实了甲基转移酶DNMT1与CADM1启动子和lncRNA-SNHG14的结合。此外,qRT-PCR和蛋白免疫印迹实验验证了 lncRNA-SNHG14对CADM1表达水平及其下游STAT3活性的调控作用。最后的挽救实验则确定了 CADM1介导了 lncRNA-SNHG14对骨肉瘤细胞增殖、侵袭和顺铂敏感性的影响。结论:本部分研究结果说明lncRNA-SNHG14通过募集甲基转移酶DNMT1并与CADM1启动子结合,促进CADM1启动子的甲基化修饰,进而调控CADM1的表达和下游STAT3信号通路的激活,影响骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和顺铂敏感性。第四部分 m6A修饰导致骨肉瘤中lncRNA-SNHG14表达上调目的:探索调控lncRNA-SNHG14在骨肉瘤中表达水平的分子机制。方法:首先利用利用DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷、HDAC抑制剂和HDAC过表达质粒分别处理细胞,观察经过上述处理后lncRNA-SNHG14水平的变化。利用甲基化RNA免疫共沉淀检测lncRNA-SNHG14中m6A的修饰水平。分别过表达METTL3和ALKBH5,qRT-PCR检测m6A水平变化对lncRNA-SNHG14表达的影响。最后进行RNA半衰期检测,验证m6A修饰对lncRNA-SNHG14稳定性的影响。结果:在DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷、HDAC抑制剂和HDAC过表达质粒分别处理骨肉瘤细胞后,lncRNA-SNHG14的表达水平无明显改变。甲基化RNA免疫共沉淀结果显示在骨肉瘤细胞U-20S和MNNG/HOS中,lncRNA-SNHG14在m6A抗体拉下的RNA片段中显著富集。分别过表达METTL3和ALKBH5后,lncRNA-SNHG14在骨肉瘤细胞中的表达水平相应上调或下调。半衰期检测结果证明m6A修饰明显增强了lncRNA-SNHG14的稳定性,延缓了 lncRNA-SNHG14的降解过程。结论:m6A修饰通过增强lncRNA-SNHG14的稳定性,促进了 lncRNA-SNHG14在骨肉瘤细胞中的表达。