论文部分内容阅读
目的:结直肠恶性肿瘤是临床诊疗中最常见的消化系统恶性肿瘤之一,近年来在全世界范围内的发病率和死亡率均有明显上升趋势,虽然现代诊疗技术发展迅猛,但总体疗效依然有限。现已证明RAS信号通路激活与恶性肿瘤的发病、进展和恶性程度密切相关,K-Ras突变型结直肠癌患者的后续治疗效果及预后明显差于K-Ras野生型患者。有研究证明IκBα(即NFKBIA)异常积聚细胞核内对K-Ras突变型肿瘤细胞有抑制作用。本课题利用基因拼接、DNA重组技术及重组蛋白表达技术,重头设计序列、构建转染质粒、生产纯化重组蛋白CPP2-DN-NFKBIA-NLS,并研究目的重组蛋白在结直肠癌细胞株中的转入情况及其对抗肿瘤作用如对细胞增殖能力、迁移能力、凋亡情况等的影响。方法:1、通过相关网站查询目的基因序列情况及相关资料,设计并优化重组蛋白CPP2-DN-NFKBIA-NLS基因序列,基因合成后通过载体pET28b(+)质粒分别转染到大肠杆菌BL21(DE3)及大肠杆菌C41感受态细菌中并通过抗生素筛选获得阳性目标大表达菌株。培养阳性菌株后利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导阳性菌株表达并分泌重组蛋白CPP2-DN-NFKBIA-NLS,并探究目标蛋白表达存在形式及最佳表达条件。裂解得到蛋白液通过his标签亲和纯化手段纯化获得纯化后的目的蛋白,并通过SDS-PAGE鉴定。通过相同方法设计并获得对照组重组蛋白DN-NFKBIA-NLS并验证。2、通过免疫荧光技术探究重组蛋白CPP2-DN-NFKBIA-NLS在结直肠癌细胞系的转入情况,研究重组蛋白的入胞情况及定位情况。3、利用MTT实验、流式凋亡实验、划痕实验检测重组蛋白CPP2-DN-NFKBIA-NLS在各结直肠癌细胞系中的影响情况,探究该重组蛋白的抗肿瘤效用。结果:1、成功构建并表达出目的重组蛋白CPP2-DN-NFKBIA-NLS及重组蛋白DN-NFKBIA-NLS,并明确目的蛋白表达条件。2、免疫荧光实验定位目的重组蛋白CPP2-DN-NFKBIA-NLS能进入结直肠癌细胞系细胞核内。3、MTT实验证明重组蛋白CPP2-DN-NFKBIA-NLS能抑制各结直肠癌细胞系的增殖;流式检测细胞凋亡实验证明目的重组蛋白CPP2-DN-NFKBIA-NLS能提高结直肠癌细胞的凋亡率;同时细胞划痕实验结果提示目的重组蛋白CPP2-DN-NFKBIA-NLS对于结直肠癌细胞系的迁移、愈合能力未见明显影响。结论:本实验综合利用了基因重组技术、重组蛋白表达技术成功构建出重组蛋白CPP2-DN-NFKBIA-NLS,并在后续的实验中证明重组蛋白在结直肠癌细胞系中表现出了良好的抗肿瘤性能,为后续研究结直肠癌发病机制及靶向性治疗提供了新的思路。