目的 探讨CEA组织特异性CD/5-FC系统对低表达CEA的大肠癌肿瘤是否具有靶向性杀伤作用，这种靶向性杀伤作用对不同CEA表达水平的大肠癌细胞有无差异。 方法 将质粒pCD2，G1CEACDNa在感受态中大量扩增后，质粒pCD2用BamHⅠ及EcoRⅠ酶切鉴定，质粒G1CEACDNa用SalⅠ酶切鉴定，用PA317细胞包装，以孔径为0.45um的滤膜过滤培养液以获得病毒上清，用Hella细胞接种计算病毒滴度。脂质体法转染大肠癌细胞，以含G418的RPMI 1640培养基选择培养，在96孔细胞培养板中进行前药5-FC对转基因大肠癌细胞的杀伤作用实验，MTT法测定活细胞比率并计算杀伤率。之后，接种Balb/c裸鼠大腿外侧皮下，观察成瘤情况，待裸鼠成瘤2周后，每天腹腔注射500mg/kg的5-FC，观察肿瘤生长情况，前药治疗21d，肿瘤标本称重后取少量组织行验证实验，制成石蜡切片，在显微镜下观察肿瘤病理学变化。在此基础上进行原位基因治疗实验。提取细胞基因组DNA行PCR检测，检测目的基因的整合情况，提取组织总的RNA，RT-PCR来检测基因的表达情况。 结果 第四军医大学博士学位论文4 pCDZ用 BamH及EcOR酶切鉴定，可见 1．skb阳性克隆，GICEACDNa用 Sal酶切鉴定，可见 1．gkb阳性克隆，脂质体法将pCDZ、GICEACDNa直接转染入大肠癌LoVo细胞及SW480细胞，PCR证明目的基因整合到靶细胞中，铺96孔板进行前药治疗后，第刀小时可观察到转基因细胞出现收缩及变形，第 5天部分细胞出现崩解死亡，以转 GI CEACDNa基因之 LoVO细胞最为明显，5FC对转基因大肠癌细胞oVO，SW480有杀伤作用，转CD基因之oVo，SW480细胞对5FC的敏感性明显提高，转GICEACDNa之LoVo细胞较转pCDZ之LoVo细胞对5IC的敏感性明显增强，其IC。。分别为0．lrTun。l／L和0．8nunol／L，而转GICEACDNa之SW480细胞对5FC的敏感性与转pCDZ之SW480细胞无显差别，其 ICs。分别为回刀 nunol／L和 0．8 frunol／L。表明在组织特异性转录调控序列 CEA TRS驱动下，胞啼陡脱氨酶基因对高表达 CEA的大肠癌细胞杀伤作用更强。重组逆转录病毒pCDZ及GICEACDNa经PA317细胞包装后，其病毒滴度分别为：7．5川允FU几及 5石X10七FU／L。将转基因瘤细胞皮下注射2周后，在注射部位均可见肿瘤生长，前药5＊C治疗3Wb后，在oVo细胞肿瘤，转pCDZ及GICEACDNa基因组肿瘤较未转基因组肿瘤明显缩小（P＜0．of，t ＝4．512，n二5；P＜0刀1，矿一3．320，n二5），GICEACDNa阳性组比 pCDZ阳性组作用更为明显（P＜0．05，t－2．375，n－5）。在 SW480细胞肿瘤，转 pCDZ及 GI CEACDNa基因组肿瘤较未转基因组肿瘤明显缩小 P＜0刀1，t＝4．547，n—5；P＜0刀1，t ＝4．475，n—5），但 GICEACDNa阳性组的抑瘤作用并不优于休＊2基因阳性组（P＞0刀5人镜下观察发现，在Lo VO结肠癌细胞肿瘤组织，对照组肿瘤细胞生长活跃，并可见核分裂相及瘤巨细胞，而转基因组标本中肿瘤细胞减少，细胞空泡变性，特别是转 GI CEACDNa基因的标本内，仅残留极少量肿瘤细胞，并可见散在成纤维细胞及炎细胞：在S WW480结肠癌细胞肿瘤组织，对照组肿瘤细胞生长活跃，可见核分裂相，转pCDZ基因及GICEACDNa基因的标本内，可见细胞大片空泡变性，灶性坏死，炎细胞浸润，以转 GI CEACDNa基因的肿瘤组织更为明显。原位转基因治疗后，亦观 第四军医大学博士学位论文5察到相似的结果。通过RTPCR检测表明目的基因整合到靶细胞后，在肿瘤组织能稳定表达。结论 1 脂质体法及逆转录病毒感染法均能成功转染质粒GICEACDNa及pCDZ， 目的基因在组织中均能稳定表达 2 重复感染对提高逆转录病毒的基因转染率有益 3 用CEA转录调控序列启动子调节胞啼促脱氨基酶的表达，对CEA阳性的 大肠癌肿瘤有靶向性杀伤作用 4 用CEA转录调控序列启动于调节胞啼吱脱氨基酶基因的表达，对高表达 CEA的大肠癌组织杀伤作用更好 5 用CEA转录调控序列启动子调节胞啼咳脱氨基酶的表达，对低表达CEA 的大肠癌组织的靶向性杀伤作用效果有限