研究背景:金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,SA,简称金葡菌）是一种重要的革兰氏阳性致病菌,在一定条件下能够感染机体,引起以急性、化脓性为特征的感染,它不仅可引起皮肤和软组织、心内膜、肺部、骨髓等局部的化脓性感染,甚至还可导致脓毒血症乃至死亡。2019年最新全国细菌耐药监测报告数据表明,金葡菌院内感染的分离率稳居革兰氏阳性菌首位,金葡菌抗生素耐药的增加导致其感染性疾病的治疗异常困难,特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）,其高度耐药性使得临床上常规抗生素治疗效果有限。金葡菌严重威胁人类健康,其感染的预防和治疗已经成为目前临床医学难题之一。疫苗免疫是防控金葡菌感染最经济、最有效的方法,但目前还未有研制成功的金葡菌疫苗供临床使用。α-溶血素（alpha-hemolysin,Hla）是金葡菌的关键致病因子之一,是疫苗的重要候选抗原。疫苗保护效果主要依赖于保护性表位诱导的免疫应答,鉴定Hla的保护性表位,以此来设计疫苗,可去除全抗原中无效以及致病表位,降低疫苗使用风险,提高疫苗效力。虽然有研究报道了Hla的保护性表位,但是由于条件限制,这些表位鉴定结果主要来源于动物实验,尚未在人体上进行验证。从动物模型中鉴定的保护性表位为人用疫苗研究提供的信息非常有限,更不能直接用于人用金葡菌疫苗的设计。铁蛋白作为一种自组装蛋白,具有极低的毒性,将表位肽偶联到铁蛋白的表面,制备纳米表位疫苗,可增强表位的免疫原性。本实验室自2009年开始研制了1.1类新药—重组金葡菌疫苗(Recombinant five SA antigen vaccine,r FSAV。疫苗的主要抗原成分有:Hla、Isd B、m SEB、Sp A5和Mnt C,目前已经完成了II期临床试验研究。本研究利用从Ib期临床试验中收集的144名志愿者血清,基于Luminex多重芯片检测技术,鉴定人体针对Hla的具有中和活性的B细胞免疫优势表位,并以此设计和构建基于自组装铁蛋白载体的纳米疫苗,为阐明疫苗的应答规律和下一步疫苗的优化打下基础。研究目的:1.建立Hla毒素溶血中和活性评价方法。2.利用金葡菌疫苗Ib期疫苗接种前（D0）和接种后14天（D14）各144名志愿者血清鉴定人体针对Hla的具有中和活性的免疫优势表位。3.制备基于中和表位的自组装铁蛋白纳米疫苗,并阐明其在小鼠皮肤感染模型中的保护作用。研究方法:1.利用大肠杆菌表达并纯化Hla毒素蛋白,制备高质量抗Hla中和性抗体,获取新鲜兔红细胞,建立Hla毒素溶血中和活性评价方法。2.利用上述建立的方法,检测金葡菌疫苗Ib期疫苗接种前（D0）和接种后14天（D14）各144名志愿者血清的中和活性。结果以抑制50%溶血活性时的抗体稀释度即—IC50来体现,即每份血清都有对应的IC50值。3.步移法合成23条Hla表位肽,随机挑选疫苗接种后14天的血清24份,利用Luminex多重芯片检测技术,检测Hla表位肽对这24份血清的反应强度。4.通过统计软件SPSS对Hla表位肽反应强度与血清中和活性进行相关性分析。制备针对中和活性相关表位的多克隆抗体,并评价其中和活性,以此鉴定具有中和活性的Hla表位。5.将鉴定具有中和活性的表位融合至自组装铁蛋白的N端,构建中和表位自组装铁蛋白纳米疫苗（Epitope based Nanoparticle,EpNP）。在大肠杆菌中表达EpNP,并采用分子筛层析、动态光散射和透射电镜检测EpNP的理化性质。6.利用Al（OH）3佐剂吸附EpNP,在第0、14、21天免疫小鼠,收集小鼠血清,检测抗Hla抗体效价以及其在体外的中和活性。用金葡菌USA300标准株经背部皮下攻毒EpNP疫苗免疫后的小鼠,评价EpNP的免疫保护效果。研究结果:1.表达并纯化Hla毒素,分子量约为33k Da。体外验证了Hla毒素的溶血活性及其抗体阻断Hla毒素溶血的作用,成功建立了Hla毒素溶血中和活性评价方法。2.完成了288份疫苗临床实验血清中和活性测定。3.随机挑选金葡菌疫苗接种后14天的24个志愿者血清,利用Luminex多重芯片检测技术,检测出血清针对Hla反应性较强的免疫优势表位。4.通过统计学分析与血清中和活性正相关的表位,成功鉴定出了Hla的中和表位Hla121-138;5.构建了携带中和表位Hla121-138的自组装铁蛋白纳米疫苗（EpNP）,纯化并获得EpNP,分子量约为25 k Da。分子筛检测其分子量为562 k Da,是单体分子量的24倍。动态光散射、电镜结果均表明Hla铁蛋白能在体外自组装形成直径为13.2 nm、呈均一性良好的纳米颗粒。6.EpNP免疫能诱导小鼠产生较强的抗Hla抗体水平,其在体外具有明显中和活性中和抗体。EpNP免疫能够通过减少皮肤感染程度,降低细菌在皮肤局部、肝、脾、肺、肾的定植,在小鼠皮肤感染模型中发挥良好的保护作用。研究结论:1.表位Hla121-138是人用金葡菌疫苗Hla抗原的中和表位。2.EpNP能在体外自组装形成均一性良好的纳米颗粒。3.EpNP免疫可诱导产生中和抗体并在小鼠皮肤感染模型上发挥保护作用。