论文部分内容阅读
目的研究整合素连接激酶(ILK)与核糖核酸酶抑制因子(RI)蛋白的相互作用,探讨两者相互作用对膀胱癌EJ细胞的ILK信号通路及EMT影响的分子机制。方法1.根据ILK基因序列设计引物,经PCR法扩增获得ILK基因片段后,分别连接到真核表达载体pEYFP-N1和pCMV-3xflag-CMVTM-10上。通过酶切和DNA测序鉴定载体,并分别命名为p EYFP-N1-ILK and pCMV-3×Flag-ILK。将pCMV-3×Flag-ILK载体和对照空白载体,以及LV5-RNH1和LV5NC分别稳定转染EJ细胞株,命名为EJ-ILK,EJ-FLAG,EJ-RI和EJ-LV5,经Western blot和细胞免疫荧光检测蛋白过表达情况。2.在EJ和HEK293细胞内进行ILK与RI的免疫共沉淀实验,荧光共振能量转移实验和免疫荧光共定位实验,用以研究体内的相互作用。在细胞外应用GST pulldown实验研究ILK与RI在体外的相互作用。3.CCK8检测各组细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期;细胞免疫荧光检测蛋白ri,ilk,p-akt和p-gsk3β表达水平;小管形成实验检测ilk和ri相互作用对体外血管生成的影响。3.收集的稳定表达细胞株ej-ilk,ej-flag,ej-ri,ej-lv5和ej,用westernblot检测ilk与ri相互作用对ej细胞emt及ilk信号通路的影响。5.构建balb/c裸鼠移植瘤模型,观察移植瘤生长,肿瘤微血管生长以及肺转移情况;应用免疫组化和组织免疫荧光检测肿瘤组织中emt相关蛋白及ilk信号通路关键蛋白的表达水平。另外,在临床人膀胱癌及癌旁组织标本中同时检测了ilk及ri蛋白的表达。结果1.测序结果显示:重组真核表达质粒peyfp-n1-ilk和pcmv-3×flag-ilk构建正确。细胞免疫荧光和westernblot结果显示ilk和ri在ej细胞中成功过表达。2.实验结果显示:ilk与ri在体内和体外均存在相互作用。4.cck8结果显示ej-ilk细胞增值能力较对照组明显增强,而ej-ri细胞则明显减弱;流式细胞分析结果表明ej-ri细胞与对照组相比,明显阻滞于s期;小管形成实验提示ri和ej相互作用能够抑制体外血管的形成。3.通过检测各组稳定表达细胞株,显示emt相关蛋白和ilk信号通路的一些关键靶蛋白呈现显著的变化。5.balb/c裸鼠注射各组细胞后,与2个对照组相比,ej-ilk组瘤重明显增加;而EJ-RI组与对照组比较,瘤重明显降低。组织免疫荧光和HE染色结果提示EJ-ILK组微血管明显增加,EJ-RI组则明显减少。肺组织HE染色实验表明,EJ-ILK组有明显肺转移,而EJ-RI组未见明显转移。免疫组织化学和免疫荧光检测结果显示:EJ-ILK组中EMT及ILK信号通路蛋白变化明显;EJ-RI组中EMT相关蛋白和ILK通路关键蛋白与对照组比较有显著变化,且与EJ-ILK组成反相关。结论1.ILK和RI在体内外均存在相互作用。2.过表达ILK促进细胞增殖,EMT以及转移。3.上调RI抑制ILK信号通路以及EMT。4.上调RI抑制血管生成,肿瘤形成以及转移。