副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)是猪上呼吸道的一种共栖菌，在特定的条件下侵入机体而引起严重的全身性疾病，以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征革拉泽氏病(Glaisser’s Disease)。该病已成为全球范围内影响养猪业的一种重要细菌性疾病。由于遗传操作工具的缺乏，对其毒力相关因子和致病机理知之甚少。外膜蛋白(OMPs)是革兰氏阴性菌外膜的主要结构，具有维持外膜结构，保证物质运输，参与细菌的致病过程等一系列的功能。OmpP2和OmpP5是H.parasuis OMPs中两个主要的成分，可能参与细菌的致病过程。本研究旨在以本地分离血清4型强毒株SC096为亲本株，利用遗传操作技术分别构建了△ompP2和△ompP5缺失株，对其进行生物学特性的研究。最后利用比较蛋白质组学方法，进一步阐明蛋白功能和在H.parasuis致病过程中的作用和分子机制。具体工作如下：　　1.H.parasuis遗传操作系统的建立及构建△ompP2和△ompP5缺失株　　利用接合转移和电击转化无法获得△ompP2和△ompP5缺失株。根据已报道自然转化方法，也无法获得基因突变株。从全基因组序列中发现ACCGCTTGT序列与已报道的USS很相似。为了证实该序列适用H.parasuis自然转化，构建了质粒pZB5。用7个分离株和4个参考菌株进行自然转化，结果只有血清4型分离株SC096能发生自然转化。为了获得更高的转化效率，从质粒与亲本株孵化时间，质粒浓度和cAMP浓度进行条件优化。在孵化5 h时转化频率最高，为4.3×10-4转化子/CFU；当质粒的浓度为0.2μg达到饱和，且转化频率最高，为3.89×10-4转化子/CFU；在无cAMP和不同浓度条件下，获得的转化子无显著差别。以上结果表明成功建立了一种改进的自然转化方法并对其进行优化，为H.parasuis的遗传操作和基因功能的研究提供了技术平台。　　利用已建立的自然转化方法，构建了质粒pZB6和pZB7，分别转化SC096菌株后，获得△ompP2和△ompP5缺失株。构建了ompP2基因单拷贝基于染色体的互补质粒pZB8，将pZB8转化到△ompP2缺失株后，获得其互补菌株。通过PCR检测和基因测序进行鉴定，结果证实构建成功。　　2.H.parasuis SC096株△ompP2和△ompP5缺失株生物学特性研究　　分别提取菌株OMPs后，SDS-PAGE电泳后发现△ompP2缺失株OMPs在37kDa处出缺失了一个主要的蛋白条带，其互补株恢复这一特性。在△ompP5缺失株中，发现在33kDa处缺失了一个主要的蛋白条带。通过生长特性的测定，发现缺失株的生长速度明显变慢，互补株恢复生长能力。说明了OmpP2和OmpP5调节了SC096菌株的生长，缺失后导致生长缓慢。通过对9种氟喹诺酮类，β-内酰胺类抗菌药物和4种有机溶剂的最小抑菌浓度(MIC)的测定来对菌株的耐药性和敏感性进行研究，结果发现△ompP2缺失株对左氧沙星、头孢克洛和苯唑西林的MICs值显著增加，对Tween-20和Triton X-100的MICs值显著降低，互补株除了苯唑西林以外都恢复正常，而△ompP5缺失株无显著的变化。说明了缺失ompP2基因后，可能影响了细胞膜的通透性，从而导致了对抗菌药物耐药性和有机溶剂敏感性的增加。在细菌形态上，△ompP2缺失株形态结构发生改变，有的细菌长度明显的增长。另外缺失株荚膜的厚度明显变薄或消失，互补株恢复正常，而△ompP5缺失株无显著的变化。说明了OmpP2影响和调节了细菌的形态结构和荚膜的合成。　　在抵抗血清中补体杀菌作用方面，SC096株具有很高的抵抗血清杀菌的能力。但是对OmpP2的缺失显著地降低了菌株对猪血清和兔血清的抵抗能力，互补株恢复抗血清的能力，而△ompP5缺失株无显著的变化。说明了OmpP2参与了抵抗血清中补体杀菌作用。以猪肾上皮细胞(PK-15)和猪脐静脉血管内皮细胞(PUVEC)为模型，研究缺失株对宿主细胞黏附入侵能力的变化。与SC096株相比，△ompP2缺失株对PK-15和PUVEC的黏附能力升高了4-5倍，而入侵能力升高了7-8倍。而互补株的黏附入侵的能力相对于缺失株显著地下降，但没有恢复到wild-type SC096株的水平。而△ompP5缺失株无显著的变化。以上结果说明了缺失ompP2基因后，导致菌株对细胞的黏附入侵的能力显著增加。　　以BALB/c小鼠为模型比较毒力，结果显示△ompP2缺失株的LD50(1.41×109 cfu)是SC096株LD50(8.90×108cfu)的1.5倍，而互补株的毒力恢复正常(8.72×108cfu)。而△ompP5缺失株(7.90×108cfu)无显著的变化。对小鼠致病性的下降可能是△ompP2缺失株激活了宿主体内的补体系统所导致。将菌株灭活后制备成油苗免疫小鼠，间隔两周二免后。用SC096株5LD50进行攻毒，结果SC096、△ompP2缺失株，互补菌株和△ompP5缺失株免疫组都能产生100％的保护。说明了△ompP2和△ompP5缺失株诱导免疫保护的能力没有下降。　　3.Wild-type SC096和△ompP2缺失株比较蛋白组学的研究　　鉴于△ompP2缺失株具有显著的生物学特性的变化，本研究应用双向电泳(2-DE)技术结合MALDI-TOF-TOF质谱技术对wild-type SC096和△ompP2缺失株进行比较蛋白组的研究，进一步探索生物学表型产生的原因。结果展示了58个显著上调或显著下调(1.5倍以上)的差异表达蛋白点，通过质谱鉴定，成功鉴定出55个显著差异蛋白。在△ompP2缺失株中，有32个蛋白是表达升高的，而23个是表达下降的。按照GO注释和COG分类，差异蛋白主要为糖代谢，转录翻译因子，脂类代谢，氨基酸代谢，核酸代谢和分子伴侣等，这表明差异蛋白主要参与细菌的能量代谢和细胞膜的合成等过程。以上结果揭示了缺失ompP2基因后生长缓慢和细胞形态变化的原因。因此，缺失ompP2基因导致了广泛的蛋白表达的改变，能为进一步解释△ompP2缺失株新生物学特性产生的原因和为研究OmpP2功能和分子机制提供了有价值的信息。　　4.RfaD，ThyA和Mip过量表达导致了△ompP2缺失株黏附入侵的升高　　从SC096株中提取纯化的OmpP2蛋白处理宿主细胞后，感染SC096菌株，观察细菌黏附和入侵的数量的变化。结果发现细菌黏附数和入侵数显著下降，表明OmpP2参与了H.parasuis对细胞的黏附入侵作用。既然OmpP2参与了黏附入侵机制，为什么ompP2基因缺失后黏附入侵会极显著的提高?预测可能是缺失后导致了某些参与黏附入侵相关蛋白的表达量升高而引起△ompP2缺失株黏附入侵能力的增加。从蛋白组学表达量升高的蛋白中发现了ADP-L-甘油-D-甘露庚糖-6-异构体(RfaD)，胸苷酸合成酶(ThyA)和巨噬细胞感染增强因子(Mip)可能参与了△ompP2缺失株的黏附入侵的作用。为了证实这一假设，利用已建立的自然转化方法，以SC096菌株为亲本株，分别构建了△rfaD，△thyA和△mip缺失株。检测黏附入侵能力的变化。结果发现△rfaD，△thyA和△mip缺失株的黏附入侵能力都显著的下降。再以△ompP2缺失株为亲本株，分别构建△ompP2△rfaD，△ompP2△thyA和△ompP2△mip双基因缺失株，检测其对宿主细胞的黏附入侵能力。结果发现双基因缺失株的黏附入侵能力也都显著的下降，有的甚至恢复到wild-type SC096株对宿主细胞的黏附或入侵的水平。以上结果证实了RfaD，ThyA和Mip调节了H.parasuis的黏附入侵作用，和RfaD，ThyA和Mip过量表达导致了△ompP2缺失株黏附入侵的升高。