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研究背景甲状腺癌作为常见的内分泌器官来源的恶性肿瘤,发病率呈逐渐上升趋势,其中最常见的类型是甲状腺乳头状癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)。经过有效合理的治疗,PTC一般有着良好的预后,但是有部分乳头状癌具有较高的侵袭性,出现肿瘤进展、转移和术后复发等,导致患者的生存率及生存质量下降。研究显示甲状腺癌患者中有20～40%的病人发生肿瘤复发,3～15%甲状腺癌患者存在远距离转移,如果在疾病诊断时即存在远距离转移,则此类患者预后更差,5年生存率仅为50%。因此,研究PTC细胞的生长、浸润和转移过程,寻找PTC中差异性表达、预测肿瘤侵犯、转移的生物学标记和干预治疗的分子,对于进一步提高患者的治愈率与生存率具有重要的意义。癌上皮细胞在某些因素作用下可以发生形态改变、丢失极性,细胞间黏附性下降、经过细胞骨架重塑并获得表达间质细胞成分,从而展现出迁移的表型,这个过程被称为上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT),其分子标志物包括上皮细胞标志物E-钙黏蛋白(E-Cadherin)、角蛋白,间质细胞标志物如波形蛋白(Vimentin)、N-钙黏蛋白(N-Cadherin)等。通过EMT,肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力,在肿瘤转移中发挥作用,这是对于肿瘤转移解释的重要理论,是近年的研究热点。研究显示,EMT在甲状腺癌细胞侵袭迁移中起重要作用。骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins,BMPs)是一个细胞外信号分子家族,是转化生长因子-β(Transforming growth factor-beta,TGF-β)超家族的成员之一。BMPs拥有多种作用,能够调节细胞的增殖、分化、凋亡和迁移、决定细胞命运,并且研究表明BMPs在各种恶性肿瘤中存在异常表达现象,在肿瘤生长及侵袭迁移中发挥重要作用。BMPs发挥作用主要是通过Smad依赖性及非Smad依赖性两条信号通路,其中Smad依赖性通路(即骨形成蛋白信号通路)是一个经典的信号通路,Smad蛋白是该通路中细胞内信号传导的枢纽,其中受体调节Smads(R-Smads)包括Smadl、2、3、5、8,BMPs信号转导通路中是Smadl、5、8参与。此外BMPs还可激活其他信号通路来发挥作用,如细胞外调节蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases,ERK)、p38 丝裂原活化蛋白激酶(p38 Mitogen-activated protein kinases,p38 MAPK)通路。作为BMPs家族的一员,BMP-4在调节各种类型细胞的生物学行为方面有着广泛的作用,例如对于胚胎发生、个体形成、非对称器官的生长以及造血系统的发育等都有着影响。研究表明,BMP-4蛋白在多种类型肿瘤里表达异常,且与肿瘤的生长、侵袭迁移及预后有关,并且多项研究表明BMP-4与肿瘤细胞的上皮间质转化有关。迄今为止,关于BMP-4在PTC中作用的研究尚未见报道。既然研究发现PTC的侵袭及转移与上皮间质转化有关,而BMP-4在诱导上皮间质转化中发挥重要作用,并且BMP-4对肿瘤细胞的生长也有影响,那么BMP-4在PTC中表达如何?对PTC细胞的生物学特性是否有影响?是否可促进PTC细胞发生上皮间质转化?BMP-4在PTC中发挥作用相关的信号通路是什么?针对上述问题,本研究进行了探讨。第一部分BMP-4在甲状腺乳头状癌组织中的表达及与侵袭转移的关系目的研究Bone morphogenetic protein 4(BMP-4)在甲状腺乳头状癌组织中的表达及与肿瘤侵袭转移的关系。方法1.收集青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院甲状腺外科收治的82例PTC患者的癌组织及其中41例患者的癌旁组织,所选病例均经病理诊断为PTC,并收集患者的临床病理资料。2.采用免疫组织化学方法检测PTC组织及癌旁组织中BMP-4的表达。3.分析BMP-4表达与PTC患者临床病理特征之间的关系(性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤是否多灶、有无包膜浸润、有无淋巴结转移及TNM分期)。结果1.PTC组织中存在BMP-4的表达,BMP-4蛋白位于细胞浆内,呈弥漫性分布,表达强弱不等,由弱阳性到强阳性。癌旁组织中BMP-4表达为阴性。BMP-4在PTC与癌旁组织中的表达有显著差异。2.PTC组织中BMP-4的表达与患者的性别、多灶性、淋巴结转移无相关性(P均>0.05)。BMP-4在年龄≥45岁组患者中的高表达率高于年龄<45岁组(P<0.01),在肿瘤>1cm患者中的高表达率高于肿瘤≤1cm患者(P<0.01),在有包膜浸润患者中的高表达率高于无包膜浸润患者(P<0.01),在TNM分期Ⅲ+Ⅳ期患者中的高表达率高于Ⅰ+Ⅱ期患者(P<0.01)。结论1.在PTC组织中检测到了 BMP-4蛋白的表达,BMP-4的表达在癌与癌组织中存在显著差异。2.BMP-4可能与PTC的发生发展有关,伴有高表达BMP-4的PTC患者更容易发生肿瘤的侵袭转移。第二部分BMP-4对甲状腺乳头状癌细胞生物学特性的影响目的1.检测PTC细胞中BMP-4的表达情况。2.研究BMP-4对PTC细胞B-CPAP、TPC-1生物学特性的影响。3.研究BMP-4对PTC细胞B-CPAP、TPC-1表达上皮间质转化标志物的影响。4.探讨BMP-4在PTC中发挥作用相关的信号通路。方法1.细胞中总RNA抽提。2.实时荧光定量PCR(qPCR)检测PTC细胞株B-CPAP、TPC-1及K1中BMP-4基因的表达,筛选出BMP-4表达量较低及较高的细胞株进行后续实验。3.据qPCR检测结果挑选BMP-4表达量较低的细胞株B-CPAP给予过表达BMP-4处理,对BMP-4表达量较高的细胞株TPC-1给予干扰BMP-4的表达。4.细胞感染:①实验分组:B-CPAP细胞分为阴性对照组(NC组:感染阴性片段)和过表达组(OE组:感染过表达BMP-4重组慢病毒)。TPC-1细胞分为阴性对照组(NC组:感染无效干扰片段)和干扰组(KD组:感染干扰BMP-4重组慢病毒)。②细胞状态良好,未出现大量死亡现象,对照组与干预组细胞状态相当。感染后72 h左右,荧光显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白的表达,评估感染效率。③qPCR检测B-CPAP的BMP-4过表达效率及TPC-1细胞BMP-4的干扰效率。5.MTT法检测BMP-4对B-CPAP及TPC-1细胞增殖力的影响。6.流式细胞术检测BMP-4对B-CPAP及TPC-1细胞凋亡的影响。7.侵袭实验检测BMP-4对B-CPAP及TPC-1细胞侵袭力的影响。8.qPCR检测BMP-4对B-CPAP及TPC-1 细胞 E-Cadherin、Vimentin及 Smadl基因表达的影响。9.Western Blotting法检测BMP-4对B-CPAP及TPC-1 细胞 E-Cadherin、Vimentin及Smad1蛋白表达的影响。结果1.qPCR技术检测PTC细胞株B-CPAP、TPC-1及K1中BMP-4基因的表达情况,结果显示:B-CPAP细胞中BMP-4基因表达量是K1细胞的0.03倍,TPC-1中BMP-4基因表达量是K1细胞的1.13倍,选择BMP-4表达量较低的B-CPAP及表达量较高的TPC-1细胞株进行后续实验。2.将过表达BMP-4重组慢病毒感染B-CPAP细胞及干扰BMP-4重组慢病毒感染TPC-1细胞后72小时,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,结果显示细胞感染效率达到70%以上。3.qPCR检测过表达BMP-4重组慢病毒感染后B-CPAP细胞BMP-4的表达情况,检测干扰BMP-4重组慢病毒感染TPC-1细胞后BMP-4的表达情况,结果显示B-CPAP细胞中过表达组BMP-4基因表达量是对照组的17.11倍,明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01),表明过表达有效。TPC-1细胞中,相对阴性对照组,干扰组细胞的BMP-4基因敲减效率为94.4%,差异有统计学意义(P<0.01),表明干扰有效。4.MTT增殖实验结果显示,过表达BMP-4重组慢病毒感染B-CPAP细胞,培养5天后,经MTT处理4小时,与阴性对照组比较,过表达组细胞吸光度值明显升高,细胞的增.殖倍数也明显升高,差异有统计学意义(P<0.01),表明BMP-4过表达可促进B-CPAP细胞增殖。干扰BMP-4重组慢病毒感染TPC-1细胞,培养5天后,经MTT处理4小时,在第5天与阴性对照组比较,干扰组细胞吸光度值明显降低,细胞的增殖倍数也明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)表明干扰BMP-4可抑制TPC-1细胞的增殖。5.细胞凋亡检测结果显示:过表达BMP-4重组慢病毒感染B-CPAP细胞,培养5天后,阴性对照组与过表达组细胞凋亡率均低于5%,提示两组细胞均未发生明显凋亡。干扰BMP-4重组慢病毒感染TPC-1细胞,培养5天后,对照组细胞的凋亡率低于5%,提示未发生明显凋亡,而干扰组细胞凋亡率明显升高,与对照组比较差别有统计学意义(P<0.01)。6.侵袭实验结果显示过表达BMP-4重组慢病毒感染B-CPAP细胞后,过表达组转移细胞数虽然高于对照组,但两组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。干扰BMP-4重组慢病毒感染TPC-1细胞,干扰组转移细胞数低于对照组,两组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。7.给予处理因素后B-CPAP、TPC-1细胞表达上皮间质转化标志物E-Cadherin、Vimentin及BMP-4信号通路中Smadl的变化。qPCR 及 Western Blotting 结果显示,B-CPAP 中,E-Cadherin、Vimentin 表达量在过表达组及对照组之间差异无统计学意义(P>0.05),Smadl表达量差异亦无统计学意义(P>0.05)。TPC-1细胞中,E-Cadherin的表达量在两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。与阴性对照组比较,干扰组Vimentin表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.01),提示干扰BMP-4表达后,Vimentin表达下降。Smad1在两组之间表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.在PTC细胞中存在BMP-4的表达。2.BMP-4能够促进PTC细胞的增殖,且可能与PTC细胞的凋亡有关。3.BMP-4可能与PTC细胞的EMT有关,间质指标Vimentin是一个有价值的观测指标。BMP-4可能与PTC的侵袭转移有关。4.BMP-4调节PTC细胞的生物学行为,不是通过Smad1发挥作用。