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研究背景髓源抑制细胞(MDSCs)由不成熟巨噬细胞、粒细胞、树突状细胞等髓系细胞组成,其对T细胞功能有很强抑制作用。MDSCs可分为两种表型:粒细胞型(G-MDSCs)和单核细胞型(M-MDSCs),两者在细胞增殖及免疫抑制功能机制上不尽相同。我们前期研究在哮喘动物模型中发现MDSCs参与了哮喘发生与发展。在给哮喘小鼠过继转移脂多糖诱导的不同表型MDSCs发现:G-MDSCs能减轻气道炎症。那么,G-MDSCs在哮喘急性期及临床缓解期患者外周血分布情况如何?是否与哮喘气道炎症的发生有关?本研究在前期动物实验基础上,拟进一步探讨其在哮喘患者外周血所占比例情况,为G-MDSCs作为哮喘急性发作临床指标做初步探索。近来,MDSCs因可进行体内诱导、体外扩增、自体和异体移植而日益成为免疫治疗关注的热点,但体外诱导效率较低及较难获得单一表型MDSCs大大限制其临床应用。课题组前期虽已成功用LPS体内诱导MDSCs生成,但诱导成功后需进一步分离提纯,步骤复杂。如前所述,我们已经探讨G-MDSCs与哮喘小鼠气道炎症关系及其在哮喘患者外周血情况。那么,为了进一步阐明其在哮喘中的作用,并用于哮喘等免疫性疾病的治疗,建立高效G-MDSCs体外诱导体系值得研究。因此,本研究拟采用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)体外定向诱导G-MDSCs,寻找体外诱导纯化的最佳条件,同时探索诱导信号通路,为建立有效的G-MDSCs诱导体系及推进其临床应用打下基础。第一部分G-MDSCs在哮喘患者外周血水平观察目的研究哮喘患者外周血MDSCs及其不同表型G-MDSCs和M-MDSCs所占比例情况。方法收集就诊于南方医科大学珠江医院33例哮喘急性期患者,16例缓解期哮喘患者和15例健康对照者外周静脉血5ml;将血标本处理后用抗体标记,流式细胞仪检测MDSCs及其不同表型所占比例。结果1.三组 FeNO、PEF、MMEF%pred、MEF75%pred 和 MEF50%pred 差异有统计学意义(均P<0.05)。2.MDSCs占外周血单个核细胞比例在急性期哮喘组中最高,三组差异有统计学意义(P=0.003),而G-MDSCs及M-MDSCs所占比例无统计学差异(均P>0.05)。3.各组G-MDSCs所占比例均高于M-MDSCs,且差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论MDSCs占外周血单核细胞比例在急性期哮喘组最高,而其不同表型并无差异。G-MDSCs在哮喘患者或是正常人中均为主要表型。第二部分G-MDSCs体外诱导分化条件及免疫抑制功能研究目的探讨G-CSF体外诱导骨髓细胞定向分化成G-MDSCs适宜条件及其对T细胞免疫抑制功能研究。方法于BALB/c小鼠无菌获取骨髓细胞,利用GM-CSF联合不同浓度梯度G-CSF,加或不加脂多糖(LPS)体外刺激骨髓细胞,在不同时间点用流式检测MDSCs及其不同表型所占比例;用不同浓度GM-CSF加或不加G-CSF刺激骨髓细胞,流式检测G-MDSCs比例;用诱导分化MDSCs与CFSE标记淋巴细胞共培养,流式检测淋巴细胞增殖率。结果1.随G-CSF浓度增加,G-MDSCs所占比例明显增加,各组之间差异有统计学意义(P=0.001),G-CSF(50ng/ml)为最适浓度,且第5天增多最为明显(均P<0.001)。2.G-CSF联合LPS组G-MDSCs比例较无LPS组减少(均P<0.05)。3.MDSCs与T细胞共培养组较无MDSCs组T细胞增值率下降(均P<0.05)。结论G-CSF体外可诱导MDSCs生成,且促进G-MDSCs表型分化,50ng/ml G-CSF刺激时间5天为适宜诱导条件,诱导生成的MDSCs具有免疫抑制功能。第三部分G-CSF体外定向诱导G-MDSCs信号通路机制研究目的探讨G-CSF体外诱导骨髓细胞定向分化成G-MDSCs信号通路。方法不同浓度梯度G-CSF(0,5,10,50,100ng/ml)刺激骨髓细胞,3-5天后收集细胞,分别提取核酸及蛋白,用RT-PCR和Western blot检测STAT3、C/EBPβ表达量。结果1.STAT3和C/EBP β mRNA表达情况:各组STAT3 mRNA表达量无明显区别(P00.24),C/EBP β在各组表达量差异有统计学意义(P=0.002),除5ng/ml组以外,其余较对照组均有显著增加,50ng/ml组最明显(P<0.001,P<0.001,P=0.003 和 P=0.001)。2.STAT3和C/EBP β蛋白表达情况:总STAT3在各组无明显差异(P=0.739),p-STAT3随剂量增加而上升,其中50ng/ml组最显著(均P<0.001)。C/EBPβ及p-C/EBPβ在各组差异均有统计学意义(P=0.018和P=0.03),50ng/ml组升高最为明显。结论p-STAT3与p-C/EBPβ表达量随浓度增高增加,且两者变化趋势相同,G-CSF可能是通过STAT3/C/EBPβ日信号通路调控G-MDSCs定向分化。