动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是一个慢性炎症反应过程,是心血管疾病致死的主要病因之一。在AS斑块形成早期,循环血中的单核细胞在趋化因子和黏附分子的作用下进行趋化迁移,被募集到激活、感染或损伤的部位,并通过与内皮黏附,进而渗出到血管内膜。随后,分化为巨噬细胞,一方面促进炎症和细胞因子的分泌,另一方面吞噬修饰化炎性脂质颗粒形成泡沫化细胞,诱导并激活下游效应,从而促进AS性疾病进展。由于单核细胞在AS发生过程中的作用位点主要在血管腔外,因此单核细胞迁移及黏附的能力是其功能发挥的关键。莪术奥酮二醇（Zedoarondiol）是从破血散结代表药莪术中分离得到的一种天然倍半萜化合物,前期研究发现Zedoarondiol可以作用于抑制炎症反应、保护内皮细胞、减少平滑肌细胞增殖等多个与AS相关病理环节。然而,Zedoarondiol是否可以通过调控单核细胞迁移及黏附过程发挥抗AS的作用,目前尚未有研究报道。基于此,我们提出“莪术有效成分Zedoarondiol具有抗动脉粥样硬化的作用,机制与其调控单核细胞迁移及黏附有关”的假说,围绕这一假说,本研究首先基于网络药理学探索莪术有效成分Zedoarondiol抗动脉粥样硬化的作用机制;利用ApoE-/-小鼠AS模型,观察Zedoarondiol抑制ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成、抑制白细胞迁移及黏附的效应;体外研究采用CCL2诱导的THP-1单核细胞迁移和ox-LDL损伤的HUVECs模型,观察Zedoarondiol调控单核细胞迁移及与内皮细胞黏附的效应;通过对ApoE-/-小鼠主动脉细胞进行单细胞转录组测序及生信分析,探究Zedoarondiol调控单核细胞迁移及与内皮细胞黏附的关键基因或通路,并通过体外拮抗关键基因或通路的表达,验证Zedoarondiol抗动脉粥样硬化的分子机理。研究一 基于网络药理学研究莪术有效成分Zedoarondiol治疗动脉粥样硬化的作用机制目的:探究莪术有效成分Zedoarondiol治疗AS的潜在作用靶点及干预途径。方法:根据Zedoarondiol的3D结构,获取Zedoarondiol的作用靶点,通过与AS的疾病靶点取交集,获得Zedoarondiol对AS的潜在治疗靶点。通过STRING 11.0构建Zedoarondiol对AS的潜在治疗靶点PPI网络,利用FUNRICH3.1.3进行基因功能富集分析及可视化,利用David v6.8数据库进行信号通路的富集分析。将Zedoarondiol靶点及通路信息导入Cytoscapev3.7.2软件,构建Zedoarondiol治疗AS的“药物成分—靶点—通路”网络。结果:将Zedoarondiol的作用靶点与疾病作用靶点取交集,得到Zedoarondiol治疗AS的潜在作用靶点105个。通过PPI网络的构建,获取度值排名前十的基因为:ALB、SRC、HRAS、EGFR、MAPK8、IGF1、HSP90AA1、MMP9、CASP3、MAPK14。GO分析结果显示共有101个相关生物过程具有统计学意义,其中与AS相关的生物过程主要涉及EGFR依赖的内皮信号转导、P38 MAPK信号通路、TGF-β信号通路、整合素激酶相关通路、TNF信号通路等;KEGG分析结果显示与潜在作用靶点相关的信号通路有78条,其中与AS发病机制相关的通路主要包括PI3K-Akt信号通路、黏附连接相关通路、VEGF信号通路、MAPK信号通路、趋化因子信号通路等。“药物成分—靶点—通路”网络显示共有21条信号通路与AS相关基因中的23个基因之间存在197条关联。结论:Zedoarondiol可能通过调节机体的P38MAPK信号转导、整合素激酶相关信号转导、EGFR依赖的内皮信号转导、TGF-β信号转导、TNF信号转导等生物学过程,通过MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、黏附连接相关通路、趋化因子信号通路等干预AS的发生发展。研究二Zedoarondiol对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的影响目的:观察莪术有效成分Zedoarondiol抗AS的作用。方法:通过高脂喂养的ApoE-/-小鼠建立AS模型,实验共分为4组:模型组12 只,Zedoarondiol（20mg/kg/d）给药组 12 只,阿托伐他汀钙片（20mg/kg/d）阳性对照组12只,C57BL/6正常对照组12只。高脂喂养8周后,连续灌胃给药10周。油红染色法评估全长主动脉及主动脉根部AS斑块的形成情况;生化法检测小鼠血脂水平变化;流式细胞术检测小鼠趋化因子MCP-1及炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-17A的表达水平;肠系膜小静脉微循环法检测白细胞与内皮细胞黏附水平;ELISA法检测黏附分子ICAM-1、VCAM-1的表达水平。结果:给药10周后,主动脉全长及主动脉根部冰冻切片油红染色显示,与模型组相比,Zedoarondiol组小鼠主动脉全长及主动脉根部的斑块面积均明显减少（P＜0.05）。与模型组比较,Zedoarondiol组血清TC、TG含量均降低（P＜0.05）;与模型组比较,Zedoarondiol组血清LDL-C含量降低,HDL-C含量升高,但与模型组比较,均无显著性差异（P＞0.05）。Zedoarondiol可显著下调趋化因子MCP-1（P＜0.001）以及炎症因子TNF-α、IL-1β（P＜0.05）水平;与模型组相比,Zedoarondiol组血清IL-6和IL-17A均有降低,但无统计学差异（P＞0.05）。小鼠肠系膜小静脉微循环结果显示,Zedoarondiol可提高ApoE-/-小鼠肠系膜小静脉内白细胞的运动速率（P＜0.05）,减少白细胞-内皮细胞的黏附数量（P＜0.05）。ELISA结果显示,Zedoarondiol可以降低血管内皮中ICAM-1、VCAM-1水平（P＜0.05）。结论:Zedoarondiol抑制ApoE-/-小鼠全长主动脉及主动脉根部斑块的形成,降低血清TC、TG和炎症因子MCP-1、IL-1β、TNF-α水平,改善微循环中白细胞运动速率、白细胞-内皮黏附等炎症状态,降低血清黏附因子VCAM-1和ICAM-1水平。研究三Zedoarondiol调控单核细胞迁移及与内皮细胞黏附的研究目的:观察莪术有效成分Zedoarondiol对趋化因子CCL2诱导的THP-1单核细胞迁移及与内皮细胞黏附的调控作用。方法:本研究采用趋化因子CCL2（100ng/ml）诱导的单核细胞迁移模型,通过Transwell实验观察THP-1单核细胞的迁移;利用ox-LDL诱导的HUVECs损伤模型,通过黏附实验观察Zedoarondiol对THP-1单核细胞与损伤内皮之间的黏附,Western Blot检测内皮细胞释放的黏附分子表达水平。结果:与model组相比,Zedoarondiol 20μg/mg和40μg/mg可显著降低趋化因子CCL2作用下的单核细胞迁移作用,迁移率分别下降47%（P＜0.001）和62%（P＜0.001）。与 ox-LDL 组相比,Zedoarondiol（20、40μg/mg）均降低 THP-1 细胞与HUVECs的黏附反应（P＜0.05）。与ox-LDL组相比,Zedoarondiol 3个剂量组均可以下调VCAM-1和ICAM-1蛋白的表达（P＜0.05,P＜0.001）;40 μg/mL Zedoarondiol可以下调E-selectin蛋白的表达（P＜0.05）。结论:Zedoarondiol抑制单核细胞的趋化迁移,抑制内皮-单核细胞的黏附,调节内皮细胞黏附分子VCAM-1、ICAM-1、E-selectin的表达水平。研究四基于单细胞转录组学研究Zedoarondiol抗动脉粥样硬化的分子机理目的:通过单细胞转录组学技术,探索Zedoarondiol抗AS的分子机制。方法:ApoE-/-小鼠随机分为Model组,Zedoarondiol（20mg/kg/d）,另取同源C57BL/6小鼠作为正常对照组。高脂喂养8周后,连续灌胃给药10周,眼内眦静脉取血,剥离全长主动脉,制备外周血单个核细胞（PBMC）及主动脉单细胞悬液。按照10X说明书步骤,对细胞悬液中的细胞进行数量及活力检测及其文库构建,然后进行上机测序及生信分析。结果:数据过滤后共得到24004个细胞。在细胞分群中我们选取了前20个PCA维度,通过执行findCluster函数我们共得到了 9种细胞类群。使用FindAllMarkers函数计算出所有细胞类群的marker基因。利用所获得的高质量marker基因,通过参考Mouse Cell Atlas和Cell Marker将所获得的细胞类群分别注释为 VSMC、T cell、Macro、B cell、Fibro、Myeloid、Mono、Neut、EC。EC细胞的组间对比显示,Vcam1、Fbln5、Col5a2、Col18a1、Rps5等基因与AS相关基因的表达存在显著差异,其可能是调控Zedoarondiol抗AS的关键基因。Mono细胞的组间对比发现多条与AS相关的信号通路包括趋化因子-趋化因子受体通路、TNF信号通路、趋化因子介导的信号通路、NF-κB信号通路等。我们将EC细胞使用subset的方式取出并进行分辨率更高的分群,获得了 Cd36EC、Pecam1EC 亚群;将 Mono 细胞分为 cluster 0、cluster 1、cluster 2 亚群。EC 细胞亚群的功能分析结果显示,生物功能主要富集在细胞-细胞黏附、细胞-细胞基质黏附、单核细胞迁移、内皮细胞迁移等于黏附、迁移有关的方面。Mono细胞亚群功能分析显示,主要富集在趋化方面,包括趋化因子介导的信号通路、ERK1和ERK的级联反应、多种细胞的趋化等。细胞通讯共富集到了 75个EC与Mono的细胞通讯通路,其中有4条通路与单核细胞迁移及黏附相关,包括CXCL、JAM、ICAM、VCAM信号通路。通过进一步对通路上富集的基因进行细胞通讯分析,CXCL12/CXCR4通路可能是Zedoarondiol调控单核细胞迁移及与内皮细胞黏附,从而发挥抗AS作用的具体作用途径。结论:CXCL12/CXCR4通路可能是Zedoarondiol调控单核细胞迁移及与内皮细胞黏附,从而发挥抗AS作用的具体作用途径。研究五Zedoarondiol通过调控CXCL12/CXCR4通路抗动脉粥样硬化的机制研究目的:验证Zedoarondiol通过调控CXCL12/CXCR4通路,抑制单核细胞的趋化迁移及与内皮细胞的黏附,最终发挥抗AS的作用。方法:ELISA法检测ApoE-/-小鼠血清CXCL12和CXCR4的水平;Transwell法检测Zedoarondiol对CXCL12诱导的THP-1细胞迁移和与HUVECs黏附的影响;Western Blot及RT-qPCR检测THP-1细胞CXCR4的蛋白表达水平;Western Blot检测CXCL12/CXCR4通路下游PI3K、AKT和NF-κB关键蛋白的表达。结果:Zedoarondiol降低了 ApoE-/-小鼠血清CXCR4的表达和CXCL12诱导的THP-1细胞CXCR4蛋白的表达;Transwell实验显示,Zedoarondiol可抑制CXCL12诱导的THP-1细胞迁移和与HUVECs的黏附,而CXCR4的抑制剂AMD3100可拮抗该作用。对CXCL12/CXCR4下游关键蛋白的检测表明Zedoarondiol通过调控CXCL12/CXCR4通路减少PI3K、AKT和NF-κB蛋白的表达。结论:Zedoarondiol通过调控CXCL12/CXCR4通路,减少下游PI3K、AKT、NF-κB蛋白的表达,从而调控单核细胞的趋化迁移及与内皮细胞的黏附,最终发挥抗AS的作用。