小反刍兽疫（peste des petits ruminants，PPR）是一种由小反刍兽疫病毒（pestedes petits ruminants virus，PPRV）感染所引起的急性或亚急性小反刍动物传染病，现为国际动物卫生组织必须通报疫病。PPRV属副粘病毒科、麻疹病毒属成员。成熟的PPRV是直径为400～500nm的多晶型球形粒子，外表面包被脂质囊膜并镶嵌糖蛋白纤突，纤突分别由血凝素（haemagglutinin，H）蛋白和融合（Fusion，F）蛋白构成。紧邻囊膜内层为基质（matrix，M）蛋白，分别与核衣壳（nucleocapsid，N）蛋白和囊膜表面糖蛋白的胞尾部分互相作用。病毒核衣壳呈鲱鱼骨样结构，内部包裹单股负链RNA，即病毒基因组。病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）是由病毒结构蛋白自行装配而成的近似于天然母源病毒的粒子。由于本身没有遗传物质，所以VLP缺乏复制性和感染性。而且，这种与真实病毒粒子相似的骨架结构使得VLP不仅诱导体液免疫，还可能诱导细胞免疫，若作为疫苗使用甚至不需要佐剂。杆状病毒表达系统是表达外源蛋白的有效平台，并可对其进行翻译后修饰，如多肽折叠、糖基化、二硫键形成及多肽水解。另外，杆状病毒基因组较大，可容纳较多外源基因而基本不改变病毒的生理活性，且病毒的极晚期启动子能高效表达外源蛋白。更重要地，杆状病毒通常只感染节肢动物，不会对人畜构成危害。因此该系统已被广泛用来表达外源蛋白和制备VLP。本研究在大肠杆菌中表达了两段截短形式的PPRV M蛋白，经SDS-PAGE、Western blot和MALDI-TOF-MS验证，所表达蛋白即为目的蛋白。表达条件经优化后最终确定为28°C0.2mM IPTG诱导12h，而终产物以不可溶形式存在。因此，将表达的蛋白在变性条件下进行纯化。纯化产物经弗氏佐剂乳化后免疫Balb/c小鼠，能有效诱导其产生M多克隆抗体。经ELISA分析可知，小鼠三免后血清中抗体达到较高滴度。后经Western blot和免疫荧光试验证明，制备的多抗对变性与非变性M蛋白的特异性都较为理想。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，本研究构建了PPRV M、H、N、F四顺反子重组杆状病毒。经RT-PCR分析，M、H、N、F mRNA在被感染的Spodopterafrugiperda9（Sf9）细胞中皆得以转录，但Western blot分析表明，仅有M和N蛋白获得表达。随后，本研究基于昆虫细胞，利用OptimumGeneTM软件优化了H和M开放阅读框（open reading frame, ORF）密码子，并分别构建了H和M单顺反子重组杆状病毒。Western blot和间接免疫荧光分析证明，H和M蛋白皆在Sf9细胞中获得表达，但表达量相对较低。利用密码子优化的H和M及原始M和N ORF，本研究构建了三种重组杆状病毒，即共表达M和N蛋白的病毒BV-M-N、共表达M和H蛋白的病毒BV-M*-H*、共表达M、H和N蛋白的病毒BV-M*-H*-N（“BV”及“*”分别代表重组病毒和密码子优化）。经Western blot、流式细胞术、间接免疫荧光及激光共焦显微镜分析，目的蛋白皆获得表达。后经细胞超薄切片、免疫胶体金标记及透射电镜观察证明，三种重组病毒表达的蛋白皆可在昆虫细胞中自行组装成VLP，并出芽释放。BV-M-N表达所形成的VLP呈无纤突状结构、而BV-M*-H*及BV-M*-H*-N表达所形成的VLP则具有纤突结构，偶尔也可在BV-M*-H*-N所制备的样品中观察到鲱鱼骨样衣壳。收集BV-M*-H*和BV-M*-H*-N感染细胞培养上清（SM*H*和SM*H*N），分别进行蔗糖密度梯度离心纯化VLP（VLPM*H*和VLPM*H*N），并将SM*H*、SM*H*N、VLPM*H*和VLPM*H*N分别免疫Balb/c小鼠，一免三周及二免两周后分别收集血清分别进行ELISA、病毒中和试验分析。结果表明，无论是否经过佐剂乳化，SM*H*、SM*H*N、VLPM*H*和VLPM*H*N不仅可诱导特异性H和N抗体，而且能诱导中和抗体。然而，四份样品皆难以诱导小鼠分泌α干扰素、γ干扰素、白细胞介素4及白细胞介素10。