论文部分内容阅读
硫酸软骨素AC酶（ChonAC）是一类糖胺聚糖裂解酶,可以通过β-消除机制切断连接半乳糖胺和葡萄糖醛酸β,1→4糖苷键,从而降解能降解硫酸软骨素A、硫酸软骨素C及透明质酸等糖胺聚糖,生成一系列寡糖,主要是不饱和二糖。ChonAC可用于制备低分子量硫酸软骨素、肝素尾料的处理、硫酸软骨素寡糖结构的分析以及脊髓损伤的治疗。本文克隆了三种不同菌种来源的ChonAC,构建了含有6×His的重组质粒,并在大肠杆菌中进行异源表达,获得比活力高的ChonAC,对其表达条件进行优化,并研究其酶学性质,通过分子对接对酶分子和底物分子之间的相互作用进行研究,主要研究内容如下:1)筛选到来源于Pedobacter sp.ok626、Pedobacter rhizosphaerae DSM18610和Pedobacter xixiisoli的三种ChonAC,分别命名为PschonAC、PrchonAC和PxchonAC,编码702、701和699个氨基酸残基。BLAST结果显示三种ChonAC与来源于Flavobacterium heparinum的ChonAC（Fhchon AC）的序列一致性分别为43.5%、63.48%和52.65%。构建三种重组表达载体pET-28a-ChonAC,并在大肠杆菌BL21（DE3）进行异源表达。2)对三种ChonAC的表达条件进行优化。PschonAC的最适诱导温度为15 oC,IPTG浓度为30μM,诱导时间为30 h,得到的粗酶活力为150 U L-1,经Ni-NTA纯化后的比活力为35 U mg-1,SDS-PAGE结果显示明显单一的蛋白条带,分子量76.08 k Da。PrchonAC的最适诱导温度为20 oC,IPTG浓度为0.1m M,诱导时间为12h,得到的粗酶活力1500 U L-1,经Ni-NITA纯化得到一条明显的目的蛋白条带,分子量为77 k Da,比活力150 U mg-1。PxchonAC的最适IPTG浓度为0.1 m M,诱导温度为25 oC,诱导时间为15h,得到的粗酶活力5082 U L-1,通过Ni-NTA纯化得到的单一的蛋白条带,分子量为76.8k Da,比活力428.77 U mg-1。3)对三种重组ChonAC的酶学性质进行研究。PschonAC在50 m M,p H 7.5的PBS缓冲液中相对酶活力最高。PschonAC催化反应的最适温度为25 oC,在此温度下的半衰期200 min,大部分金属离子对酶活力无明显影响,Co2+对PschonAC的酶活力有抑制作用。PschonAC的Km和Vmax分别为0.37 mg m L-~1和39.2 U mg-1,PschonAC在4 oC下储存18天后能保持初始活力的64%。PrchonAC催化反应的最适反应条件为:35 oC,20 m M p H7.5 Tris-HCl,20m M Ca2+。以硫酸软骨素A、C和透明质酸为底物,Km值分别为1.68、0.14和0.34 mg m L-1,Vmax分别为479.39、24.46和124.36 U mg-1。PrchonAC在25 oC中的半衰期有20 min,在4 oC中储存10天后,仍保留初始活力的90%以上。PxchonAC在降解硫酸软骨素A时最适反应温度和p H分别为40 oC和p H 8.0 Tris-HCl。以硫酸软骨素A为底物,PxchonAC的Km和Vmax分别为0.61 mg m L-1和670.18 U·mg-1。Ca2+对PxchonAC酶活力有明显的促进作用,且在Ca2+的存在下,PxchonAC在37 oC的半衰期提高了6.3倍,PxchonAC的酶活力在Zn2+的存在下降94.3%。PxchonAC在25和37 oC的半衰期分别为3,300和660 min,在4 oC储存时的半衰期有27天。4)分子结构研究。以Fhchon AC（PDB:1CB8）为模板,在Swiss-Model上进行同源建模得到三种蛋白模型通过Saves对模型评估得到的拉式图结果显示,PschonAC、PrchonAC和PxchonAC在允许区的氨基酸均达到99.8%,表明三种蛋白模型均合理。通过分子对接结果表明,PschonAC中参与催化反应的氨基酸残基有:Asn125、Trp126、Asn175、His225、Ser233、Tyr234、Arg288、Arg292和Asn374,这些氨基酸残基均为保守残基。PrchonAC与CS-A,CS-C和HA形成的氢键数分别是12,14和9个,PrchonAC与CS-C在活性口袋中形成了更多的氢键,这限制了底物在活性中心的延伸,导致酶活力下降,而透明质酸在半乳糖胺上缺少硫酸根部分,导致底物对酶的识别能力降低,这使得酶活力比以CS-A为底物的酶活力低35%。PxchonAC和PrchonAC均与Ca2+发生相互作用,但是PxchonAC与Ca2+形成的氢键数有5个,PrchonAC与Ca2+形成4个氢键数,进而影响了Loop区域的稳定性,导致PrchonAC的稳定性比PxchonAC低。