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目的 自20世纪90年代初期神经干细胞的概念应用于神经系统的研究以来，对神经干细胞的研究就成为神经科学的热点，随着神经干细胞分离，培养的成功，探索其增殖，分化机制则成为人们关注的焦点，尤其是其定向分化更是倍受注目。神经干细胞是一种多能干细胞，在体外它能在含EGF或／bFGF的无血清培养基中保持不断增殖状态，并一直保持干细胞的特性，它们在一定诱导因素的作用下，具有分化成星形胶质细胞，少突胶质细胞和神经元的潜能。神经干细胞的增殖分化可受各种因素的影响，目前已知，许多细胞因子，生长因子，营养因子以及细胞外环境等因素的作用，可诱导神经干细胞向不同的终末细胞分化，若能在体外分离培养神经干细胞并在促分化因子的作用下，诱导神经干细胞向某一特定方向分化，将为干细胞的分化机制提供有力的实验依据。 细胞骨架是真核细胞胞质内存在的纤维网状结构，，由微管，微丝及中间丝构成，细胞骨架不仅与细胞形态密切相关，而且参与细胞的运动，物质转运，信息传递以及细胞分裂，分化，基因表达等多种功能。微管是细胞骨架中最粗的一种纤维丝，在活细胞内微管是一种动态的结构，在一定条件下可聚合或解聚，因此细胞内呈现了各种形态的排列方式，以适应变动的细胞质和完成它们各自的功能。微管由α和β两种微管蛋白聚合而成，其结构与功能的差异可能取决于所含微管蛋白的结构的不同。在细胞从幼稚到成熟的演变过程中，微管蛋白及微管不断发生变化以维持生长变化的细胞形态，因此细胞形态的变化依赖于微管的结构支持。 溶酶体是细胞内存在的由单层界膜包绕的细胞器，内含70多种水解酶，在细胞内可以移动，变形，参与细胞的自体及异体吞噬，是细胞内的消化器，通常情况下溶酶体呈圆形，具有特异性标志酶-酸性磷酸酶(ACPase)，自1973年首次在鸡胚中发现ACPase阳性的细管状溶酶体后，相继从多种细胞内观察到这种结构，称其为线状溶酶体，两种溶酶体被认为是溶酶体的不同时期表现形式，当其处于相对静止时，呈现为圆形，当处于激活状态则表现为线状，而且有研究认为，溶酶体不仅具有消化功能，而且还具运输作用。 在细胞内，细胞骨架维持着细胞形态并参与各种功能，有学者认为微管蛋白是细胞内的运输轨道，那么，溶酶体与微管蛋白在细胞的发育过程中有什么样的相关性呢，本实验的目的是以诱导皮层神经细胞向神经元定向分化为基础，观察皮层干细胞在定向分化过程中即神经元从幼稚到成熟的发育过程中，溶酶体和微管蛋白的相互关系，希望为神经干细胞的定向分化及神经元发育中的物质运输提供实验依据。实验方法 1.新生大鼠皮层神经干细胞原代及继代培养法:取出新生24小时之内Wistar大鼠的新生鼠，超净工作台下无菌刮取一薄层大脑皮层，剪碎，0.25%胰酶消化，过滤，离心，以1一2 xl护/d密度将细胞种植在无血清培养基中(DMEwF12(1:l)+10%B27+20n扩Inl EGF+20ng/Inl bFGF)，37℃，5%CO:孵育箱中静置培养，隔日换液一次，相差显微镜观察克隆形成情况，将培养7日形成的克隆收集，离心制成单细胞悬液，仍以原密度种植于上述培养基中进行传代培养，每7日传代一次，共传代3次。 2.培养皮层神经干细胞诱导分化:将原代及继代培养获得的神经球收集，离心，吹打制成单细胞悬液种植于去除EGF和bFGF并加人BDNF(Zn扩血)，IGF一1(10n岁d)的培养基中进行神经干细胞诱导分化，隔日换液，相差显微镜观察细胞分化形态变化。 3.免疫细胞化学方法进行神经干细胞，神经元鉴定并观察分化过程中骨架蛋白微管蛋白(p一tubulin)的表达:对原代及继代培养形成的细胞克隆进行干细胞鉴定，用免疫细胞化学方法进行Nestin组化染色，用显微镜观察。在神经干细胞诱导定向分化的不同时期(1，4，7日)分别取出长有神经元的盖玻片经4%多聚甲醛固定后进行神经元的NSE，AchE及p屯山诅i乎的免疫细胞化学染色，具体操作步骤按SABC试剂盒说明进行，用光学显微镜观察结果。 4.免疫电镜技术观察骨架蛋白一微管蛋白(p一tubulin)在皮层神经干细胞定向分化过程中的时空表达:对定向分化不同时期的神经元采用免疫电镜技术进行骨架蛋白(p一tub过in)的电镜标本制作，AO超薄切片机切片，透射电子显微镜观察p一tubtilin的分布特点。 5.应用光电镜酶细胞化学技术在光电镜下观察酸性磷酸酶(ACPase)显示的溶酶体在皮层神经干细胞定向分化不同时期神经元内的分布特点。 6.免疫荧光技术观察溶酶体，骨架蛋白在神经元分化过程中时空关系:用FITC单标溶酶体的组织蛋白酶D和Texsc red单标p一tub山n进行免疫荧光染色，荧光显微镜下分别观察溶酶体和微管蛋白p一tubulin在神经干细胞定向分化为神经元过程中细胞内的分布。同时用荧光双标技术标记骨架蛋白p一tubulin和组织蛋白酶D，用共焦激光扫描显微镜(CLSM)观察骨架蛋白和溶酶体的三维结构以及二者的时空关系。实验结果 1.新生大鼠皮层神经干细胞原代及继代培养克隆的形成:取材于新生大鼠皮层的细胞依神经干细胞培养法进行培养，将