研究目的： 鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我国南方及东南亚地区常见的一种恶性肿瘤，尤以广东省珠江三角洲一带多见，俗有“广东癌”之称。本研究结合临床资料，应用基因转染、基因沉默及体内外实验等研究方法，从人群和分子水平探讨Tiam1基因在鼻咽癌发生发展中的作用及其机制，为鼻咽癌转移的个体化基因治疗提供新靶标和新方法。 方法： 1．Tiam1在鼻咽癌中的表达及其作用 应用免疫组化SP-9000法检测71例鼻咽未分化型非角化性癌、20例慢性鼻咽粘膜炎、6例人鼻咽癌细胞株裸鼠转移模型肿瘤组织中Tiam1蛋白的表达，同时运用免疫荧光和RT-PCR方法分别检测Tiam1在6种鼻咽癌细胞株中的表达。 2．Tiam1过表达对鼻咽癌细胞株侵袭转移特性的影响 根据Tiam1基因在6种人鼻咽癌细胞株中的表达情况，选择Tiam1中度表达、具有一定成瘤及转移能力的细胞株，利用阳离子脂质体LipofectamineTM2000法将Tiam1/C1199 cDNA质粒导入人鼻咽癌细胞，G418筛选抗性单克隆后扩大培养，用RT-PCR及Western blot方法鉴定转染后Tiam1基因在细胞中的表达情况并进行体内外功能验证实验。 3．Tiam1基因沉默对鼻咽癌细胞侵袭转移特性的影响 针对Tiam1（NM_003253）靶基因序列，利用公用网站、按照RNA干扰序列设计原则，设计A、B、C、D四个RNA干扰靶点序列，将含各干扰序列的双链DNA oligo粘性两端酶切（AgeⅠ/EcoRⅠ酶切）并连接到酶切后线性化的RNA干扰载体PGC-LV-GFP上。将连接好的产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定，再进行测序比对，鉴定后的阳性克隆即为构建成功的目的基因RNA干扰慢病毒载体（即VshRNA）。将含各干扰序列的VshRNA质粒与pHelper1．0和pHelper2．0载体质粒共转染293T病毒包装细胞，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在293T细胞中测定并标定病毒滴度。分别用含Tiam1各干扰序列的慢病毒感染人鼻咽癌细胞，同时设置阴性对照。用Real-time PCR方法初步筛选有效的干扰靶点，根据Real-time PCR初步筛选结果，选择干扰效果较好的两种病毒液再次感染CNE2细胞，待感染时间达到7天后收集细胞，进行荧光定量PCR和Westernblot鉴定。选取最有效的病毒液感染的鼻咽癌细胞用于后续的体内、体外功能验证实验。 4．Tiam1相关信号通路的初步探讨 利用基因通路网站（http：//www．genome．jp/kegg/）、酵母双杂交网站（http：//visant．bu．edu/）等得到若干与Tiam1相互作用的蛋白，从中选取与Tiam1侵袭转移特性密切相关的Ankyrin1、Rac1、CD44蛋白进行研究。运用免疫荧光双标记技术验证人鼻咽癌细胞中Tiam1-Ankyrin1、Tiam1-Rac1、Tiam1-CD44的表达并进行共定位分析；采用免疫共沉淀、免疫印迹技术验证Tiam1与CD44、Ankyrin1、Rac1蛋白的相互作用，探讨Tiam1在鼻咽癌侵袭转移中参与相关信号通路及其与CD44、Ankyrin1、Rac1蛋白的相互调控关系。 结果： 1．鼻咽癌组织、鼻咽癌细胞株中Tiam1的表达 免疫组化结果表明，Tiam1蛋白在鼻咽癌组中的阳性表达得分为2．943±1．297，显著高于慢性炎症组0．700±0．923（t=7．224，P<0．01）；鼻咽癌组Tiam1蛋白表达得分与年龄无相关关系（r=0．020，P=0．871），其得分在性别之间、在T分期之间也没有统计学差异（t=1．702，P=0．093；F=1．670，P=0．182），而在有无淋巴结转移组间和有无远处器官转移组间差异具有统计学意义（t=9．005，P<0．01；t=5．069，P<0．01）。在具有转移特性的人源性鼻咽癌细胞株裸鼠模型肿瘤组织中Tiam1蛋白均呈高表达；运用免疫荧光和RT-PCR方法检测Tiam1在6种人鼻咽癌细胞株中的表达时发现，Tiam1在鼻咽癌高转移细胞株5-8F中表达（0．560±0．020）高于无转移特性的细胞株6-10B中的表达（0．110±0．010）（t=34．86，P<0．01）。以上研究结果表明Tiam1与鼻咽癌的侵袭转移特性相关。 2．Tiam1稳定转染人鼻咽癌细胞株的建立及其侵袭转移特性的变化 经RT-PCR及Western blot方法验证显示各转染克隆细胞中Tiam1的表达均高于未转染或空载体转染的鼻咽癌细胞，表明成功建立了Tiam1过表达的鼻咽痛细胞株。选取Tiam1表达最强的细胞克隆分别进行以下的体内外功能验证实验。 MTT实验结果证实，在细胞培养的第1天，转染了Tiam1的CNE2细胞的增殖能力与空载体转染组和未转染组比较没有统计学差异（F=0．740，P=0．498）；随着细胞培养天数的增加，CNE2/Tiam1组细胞的增殖能力明显超过前两组（第2-7天各细胞组单因素方差分析的F值分别为3．289、15．519、3．616、58．265、28．983、57．459，P值分别为0．073、0．000、0．059、0．000、0．000、0．000），表明Tiam1过表达增强了鼻咽癌CNE2细胞的体外增殖能力。 平板克隆形成实验、软琼脂集落形成实验结果均显示，Tiam1过表达的CNE2细胞较未转染细胞其克隆生长能力增加，差异具有统计学意义（平板克隆形成实验：t=25．065，P<0．01；软琼脂集落形成实验：F=318．960，P<0．01）。 粘附实验结果表明，Tiam1基因过表达的CNE2细胞对FN的粘附能力高于未转染细胞和空载体转染细胞，差异具有统计学意义（F=86．689，P<0．05）。 划痕试验检测Tiam1基因转染后对人鼻咽癌细胞株CNE2迁移能力的影响。方差分析结果是：Tiam1过表达增加了鼻咽癌细胞的迁移能力（F=356．753，P<0．05）。 细胞侵袭实验证明，Tiam1转染细胞与空载体转染、未转染细胞相比较，其穿过基底膜的细胞数显著增多，差异具有统计学意义（F=323．158，P<0．05）。 鼻咽癌裸鼠体内转移实验发现，在Tiam1转染组的8只裸鼠肺内均形成了明确的转移灶，在空载体转染组的9只裸鼠体内有4只形成肺内转移灶。Tiam1转染组每只裸鼠肺内所形成的转移灶个数（7．75±2．315）明显大于空载体转染组（3．78±4．549）（t=2．305，P<0．05）。其中在1只Tiam1过表达组的裸鼠肝组织内还可见散在的鼻咽癌细胞浸润。 3．Tiam1稳定沉默鼻咽癌细胞株的建立及其侵袭转移特性的改变 将含Tiam1干扰序列A、B、C、D的病毒液以及阴性对照的病毒液分别感染人鼻咽癌CNE2细胞，7天后收集细胞经过Real-time PCR的初步筛选得到，B序列干扰效果最好（0．124±0．055），C序列次之（0．156±0．045）；A和D序列的干扰效果相对较低（A，0．230±0．043；D，0．255±0．116）。与未感染组和阴性对照组比较，差异具有统计学意义（F=69．732，P<0．05）。为了确保结果的可靠性，又将含B、C干扰序列的慢病毒分别和混合感染人鼻咽癌CNE2细胞，培养7天后收集细胞再次进行Real-time PCR鉴定及Western blot鉴定，两种验证方法所得出的结果与初步筛选时所得出的结论相一致；并将感染B慢病毒的CNE2细胞命名为KD，感染阴性对照慢病毒的CNE2细胞命名NC，未感染的CNE2细胞命名CON，并进行以下的体内、体外功能验证实验。 采用流式细胞术分析三组细胞的细胞周期分布，结果发现Tiam1/KD组的CNE2细胞处于G1期的比例增高，处于S期和G2+M期细胞的比例则相应降低，与NC及CON组比较，差异具有统计学意义（F值分别为2021．007、1141．527、73．162，P<0．05），表明Tiam1干扰后细胞的增殖能力下降。 软琼脂集落形成实验结果表明Tiam1/KD细胞其单个细胞的增殖能力较未干扰的鼻咽癌细胞降低，差异具有统计学意义（F=645．863，P<0．05）。 4．鼻咽癌中Tiam1相互作用蛋白的验证 结论： 1．Tiam1基因与鼻咽癌进展密切相关，是促进鼻咽癌增殖、粘附、侵袭及转移的重要基因。 2．Tiam1、Ankyrin1和Rac1三种蛋白相互作用，可能共同参与并促进鼻咽癌侵袭转移的发生，Tiam1可能是鼻咽癌侵袭转移相关信号通路中的关键蛋白之一。 研究创新： 1．采用绿色荧光蛋白（GFP）标记的慢病毒载体和RNAi技术建立了稳定沉默Tiam1蛋白的鼻咽癌细胞系，为进一步研究Tiam1蛋白在鼻咽癌侵袭转移中的功能和作用提供一个理想的实验平台。 2．利用免疫荧光双标记技术和免疫共沉淀方法对筛选出的Tiam1相互作用蛋白在鼻咽癌细胞中进行共定位分析，初步探讨了Tiam1在鼻咽癌侵袭转移中的相关信号通路。 3．较系统地探讨了Tiam1基因在鼻咽癌中的表达及其与鼻咽癌细胞增殖、粘附与侵袭转移的关系。