研究背景：外伤、骨感染、骨肿瘤等疾病造成的缺损,需要进行骨的修复重建。临床上,通过骨移植的手段可以为机体提供机械力学支撑并促进骨的再生。目前,全世界每年骨移植的数量巨大,仅次于输血。骨缺损的治疗中,自体骨移植依然被认定为“金标准”。尽管如此,自体移植仍存在相应的缺点,如骨的供应量有限、手术时间加长、供区骨缺损、疼痛及出血等相关并发症的发生。临床上目前常用的骨移植方式还有同种异体骨移植,但它同样存在供应有限的缺点,并且还有排异反应、传播疾病的风险。随着人口的逐步增加,交通事故发生率逐步攀升,骨病、外伤以及外伤引起的感染性骨病的发病率也逐渐上升,而这些疾病往往造成大量的骨缺损,因此临床上对移植骨的需求量进一步加大,骨重建手术迫切需要一种理想的材料替代自体骨或同种异体骨。生物材料研究及制备工艺在组织工程快速发展的同时也得到了迅速的发展。研究者们正在设法通过组织工程相关技术制备合适的骨组织工程支架材料,以替代临床上常用的自体骨及同种异体骨。组织工程研究的内容主要集中在支架材料、种子细胞及生物活性因子方面。理想的骨修复材料首先应该具备良好的生物相容性、一定的机械强度、良好的生物可降解性,并且降解产物无毒性。同时,骨替代材料还应该具备良好的成骨诱导性能。目前研究的材料主要有一下几个方面：1.无机材料：如β.磷酸三钙、羟基磷灰石、磷酸钙骨水泥以及生物活性玻璃等。2.天然高分子材料：主要有胶原、藻酸盐、纤维蛋白、壳聚糖和透明质酸等。3.合成高分子材料主要有聚乳酸、聚羟基乙酸及二者共聚物、聚己内酯、聚羟基丁酸酯、聚偶磷氮等。4.复合材料：即按一定比例将两种或两种以上单一的材料以不同的方式进行复合,使复合后的材料在性能上互相优化组合、取长补短,从而制备出符合骨组织工程要求的支架材料。近年来,静电纺丝技术受到了越来越多的研究者的重视。它是利用高压电场将聚合物溶液制备成具有一定形貌特征的纳米纤维膜。通过这种方式制备的纤维膜内部纤维直径较小,能够达到纳米级别。并且这种纤维膜的结构与机体细胞外基质的结构相似,能够模拟生理条件下细胞的生存环境。因此静电纺丝技术已经作为一种细胞外基质或支架构建的方式应用于骨组织工程。聚己内酯(PCL)是一种高分子聚合物,它不仅具有良好的生物相容性,而且具有较好的机械性能。明胶(gelatin)是胶原的衍生物,具有较好的生物相容性及亲水性,有利于细胞的粘附。研究者们通常将二者结合在一起,用以制备既有良好机械性能又有良好的细胞粘附性能复合支架,以用于组织工程。脂肪源性干细胞(ADSCs)因其具有较强的自我更新及增殖分化能力,已经成为组织工程中种子细胞研究的热点。它具有能够向多个方向分化的潜能,在不同的诱导条件下,可分化为成骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、神经细胞、血管内皮细胞等细胞。它不涉及伦理道德问题,具有取材简单、来源丰富、培养方便的优点,因此在组织工程中具有极大的应用前景。羟基磷灰石是骨组织的重要组成部分,能够为骨组织提供强度支持。已有研究证明它能够促进脂肪源性干细胞的增殖和成骨分化,并且已经被广泛的应用于骨组织工程。天然骨骼不仅包含羟基磷灰石等无机成分,更包含胶原以及各种生活性因子等有机成分。目前,作为骨组织的整体,尚未被应用于骨组织工程。目前尚未见研究将天然骨粉同静电纺丝结合,用以制备骨组织工程支架。因此,本研究试图制备天然骨粉,并通过静电纺丝技术将其结合到电纺gelatin/PCL纳米纤维中,从而制得具有良好生物相容性的支架,该支架不仅具有良好的生物相容性,还包含各种生物活性因子,能够促进脂肪源性干细胞的粘附、增殖及成骨分化。基于以上背景,我们提出如下假设：通过静电纺丝技术能够将骨粉结合到gelatin/PCL纳米纤维内部；通过静电纺丝技术制备的gelatin/PCL/骨粉纤维膜具有良好的相容性,有利于ADSCs的生长、粘附及增殖。如果假设正确,我们将获得一种理想的骨组织工程支架。此项研究能够为骨组织工程中支架的制备提供新思路,对天然骨在临床及基础骨科中的深入研究具有重要意义。研究目的：利用静电纺丝计技术,制备多孔、仿生骨组织工程支架；通过透射电镜及扫描电镜手段检测所制备支架的结构特征；利用酶消化法提取SD大鼠腹股沟脂肪组织中的脂肪源性干细胞,并将干细胞与所制备的支架材料进行复合培养,以研究所制备的支架材料的生物相容性；以期通过此研究获得生物相容性好、具有多孔特征、适合ADSCs生长、粘附和增殖的骨组织工程支架,并指导其后续基础及临床研究。研究方法：1、利用全自动冷冻研磨仪制备天然骨粉；明胶和聚己内酯按10%的比重分别溶入三氟乙醇中,获得均匀的明胶和聚己内酯溶液,按1：1的比例进行混合,得到了混合溶液A；在溶液A的基础上,我们加入10%的纳米羟基磷灰石,得到溶液B；另外,在混合溶液A的基础上,加入10%的骨粉,我们得到了溶液C。通过静电纺丝技术,将三种溶液制备成纳米纤维膜支架,消毒后备用。2、支架材料的表征检测：分别取适量的骨粉和纳米羟基磷灰石行扫描电镜检测。将三种静电纺丝所制备的支架材料分别切取小片,行扫描电镜检测。在静电纺丝过程中用铜网膜收集三组材料的电纺纤维,作为透射电镜检测标本,行透射电镜检测。3、脂肪源性干细胞的分离及培养：利用酶消化法分离SD大鼠腹股沟脂肪组织内的脂肪源性干细胞,进行传代培养,选用第3代细胞进行后续实验研究。5、扫面电镜检测：细胞与材料共培养2天后,从每个实验组的培养基中分别取出材料。用梯度乙醇脱水,将样品放入冻干机中进行冻干,最后将得到的样品送扫描电镜检测。6、细胞增殖实验：将直径大小为6mm的三种材料分别放入96孔板中,随后将细胞接种在96孔板的材料上进行培养。应用CCK-8试剂盒检测细胞在不同时间点(12h,24h,48h,72h)的增殖情况,于酶标仪490 nm波长测定各孔吸光度OD值。7、细胞活力检测：首先高温高压消毒琼脂糖溶液,在凝固之前,向使用的24孔板中分别加入琼脂糖,铺满培养板底部,以防止脂肪源性干细胞在培养板底面粘附。随后将直径大小为8mm的三种支架材料分别放入24孔板中。将脂肪源性干细胞接种在各组材料上,培养48小时后,取各组材料按活死染色试剂盒说明,对材料上的脂肪源性干细胞进行染色。在倒置荧光显微镜下观察,并随机拍摄照片。最后我们应用Image-Pro Plus 6.0软件对材料上的活细胞进行计数。8、统计分析：每项实验分别进行了至少三次重复实验,获得的数据分别用均数±标准差表示。所获得的数据分别用SPSS20.0软件进行统计分析。用方差分析方法来检测各组数据间的统计学差异。P<0.05被认定为有统计学意义。研究结果：1、我们实验中的骨粉达到了微米和纳米大小级别,形状不规则。从SIGMA公司购买的纳米羟基磷灰石颗粒直径小于200nm,形状为圆球形。通过静电纺丝技术,我们成功地制备了三种支架材料,即明胶/聚己内酯纤维膜,明胶/聚己内酯/纳米羟基磷灰石纤维膜,以及明胶/聚己内酯/骨粉纤维膜。并且纳米羟基磷灰石和骨粉分别被成功地结合到了明胶/聚己内酯/纳米羟基磷灰石纤维膜和明胶/聚己内酯/骨粉纤维膜的纤维内部。2、当纳米羟基磷灰石和骨粉被结合到明胶/聚己内酯纤维内之后,纤维的直径变得更细,并且三组材料中,明胶/聚己内酯/纳米羟基磷灰石纤维膜组纤维最细。三组支架材料内部的纤维直径大小皆成正态分布。三组支架材料内部纤维直径大小存在显著差别(P<0.001)。明胶/聚己内酯纤维膜组纤维直径最大,明胶/聚己内酯/纳米羟基磷灰石纤维膜组纤维直径最小,明胶/聚己内酯/骨粉纤维膜组纤维直径大小居中。3、通过酶消化法能够成功地分离出了SD大鼠腹股沟脂肪组织中脂肪源性干细胞。脂肪源性干细胞生长状态良好。4、脂肪源性干细胞皆均覆盖在多孔复合支架材料的表面,并通过伪足向材料的内部延伸。明胶/聚己内酯/纳米羟基磷灰石纤维膜和明胶/聚己内酯/骨粉纤维膜上的细胞较多,并且细胞之间相互靠近。5、在ADSCs与纤维膜共培养的前24小时,明胶/聚己内酯纤维膜、明胶/聚己内酯/纳米羟基磷灰石纤维膜和明胶/聚己内酯/骨粉纤维膜三组材料上脂肪源性干细胞的增殖情况无明显差异,三组OD值皆低于对照组。但是在24小时后,细胞皆增殖到较高水平,而且,明胶/聚己内酯/骨粉纤维膜组细胞增殖速度超过了对照组。在48小时后,明胶/聚己内酯/骨粉纤维膜组OD值高于对照组。6、脂肪源性干细胞在三组材料上分布均匀,而且材料上的细胞主要被染成绿色,红色细胞较少。各组之间的活细胞数量存在明显差异,并且差异具有统计学意义(P<0.05),明胶/聚己内酯纤维膜上活细胞最少,明胶/聚己内酯/骨粉纤维膜上活细胞最多,而明胶/聚己内酯/纳米羟基磷灰石纤维膜上的活细胞数量居中。研究结论：1、通过静电纺丝技术,天然骨粉能够通过静电纺丝技术成功地结合到明胶/聚己内酯纤维内。2、携带骨粉的gelatin/PCL纤维膜具有良好的生物相容性,是一种较为理想的组织工程支架。3、携带骨粉的gelatin/PCL电纺纤维膜的制备及其生物相容性研究能够为后续体内及体外成骨研究奠定基础。此项研究能够为骨组织工程中支架的制备提供新思路,它对天然骨在临床及基础骨科中的深入研究具有重要意义。