第一部分整合素β6在糖尿病肾脏疾病上皮-间质转分化中的作用及机制研究研究目的作为糖尿病(diabetes mellitus,DM)常见的并发症之一,糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney diseases,DKD)的患者数量已随着DM发病率的上升出现显著的增长,但现阶段却并没有足够有效的治疗方法。DKD主要的病理改变之一是发生肾脏纤维化和上皮-间质转分化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)。整合素(integrin,ITG)是介导细胞和细胞外基质(extra-cellular matrix,ECM)之间信号交流的跨膜蛋白家族,是细胞生理调节的关键因子,主要功能是将细胞锚定在ECM上,控制细胞粘附和迁移。整合素β6亚基仅位于上皮类细胞中,只结合整合素αv亚基以形成异二聚体。整合素αvβ6结合ECM中的纤连蛋白(fibronectin,FN)以调节细胞内生理状态。本实验着眼于整合素β6在DKD发生和发展中的作用,探寻DKD可能的发生机制及潜在的治疗靶点。研究方法选取16周龄的db/db小鼠与同窝db/m小鼠,测量血糖和尿蛋白水平。马松染色和纤维化标志物FN免疫组织化学染色(immunohistochemical staining,IHC)以评估纤维化程度。肾组织进行转录组测序(RNA sequencing,RNA-Seq)与生物信息学分析,寻找表达有显著差异的基因。免疫印迹(Western blot,WB)和IHC检测确定肾脏中整合素β6和EMT指标波形蛋白(vimentin,Vim)、E-钙黏素(E-Cadherin,E-Ca)的表达水平。WB实验检测黏着斑激酶(focal adhesion kinase,Fak)、Src(sarcoma gene,Src)、Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)的磷酸化水平,并检测Notch1的表达。应用多聚赖氨酸(poly-l-lysine,PLL)和FN干预人肾小管上皮细胞(HK-2)48h,WB和免疫荧光染色(immunofluorescence,IF)检测整合素β6以及E-Ca的表达。WB实验检测HK-2细胞内Fak、Src、YAP与Notch1的表达情况。转染ITGβ6-si RNA和Notch1-si RNA以确定作用通路。收集健康对照者(NC)、DM患者(不伴发DKD)以及DKD患者的尿液,检测尿蛋白谱的变化情况。酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbentassay,ELISA)评估尿液中整合素β6的表达情况。研究结果1、与db/m小鼠相比,db/db小鼠血糖水平和尿蛋白水平明显上升,出现明显的DKD病变。db/db小鼠肾脏中胶原和FN表达增多,纤维化水平显著增加。2、实验小鼠RNA-Seq和生物信息学分析结果显示,细胞粘附功能相关基因在db/db小鼠体内明显改变。整合素β6在db/db小鼠肾脏内表达显著增加,且与其他发生显著改变的粘附功能相关基因关系紧密。3、db/db小鼠肾脏中整合素β6表达明显升高,Vim表达增加,E-Ca表达显著降低,提示db/db小鼠EMT水平明显上升。db/db小鼠Fak、Src和YAP的磷酸化水平增加,Notch1的表达增多。4、与PLL干预组相比,FN干预的HK-2细胞整合素β6表达明显增加,E-Ca表达下降,EMT程度显著升高。FN组HK-2细胞Fak、Src与YAP的磷酸化水平升高,Notch1表达水平增加,提示FN通过激活Fak/Src通路,增加YAP的磷酸化,促进Notch1表达,继而介导EMT发生。5、HK-2细胞转染ITGβ6-si RNA后,Fak、Src与YAP的磷酸化水平受明显抑制,Notch1表达水平降低,EMT程度得到缓解,提示整合素β6介导了FN诱导的肾小管上皮细胞EMT。转染Notch1-si RNA后,Vim表达水平明显下降,E-Ca表达显著上升,EMT得到明显缓解。6、与DM患者相比,DKD患者尿液中肾小管与肾小球功能标志性蛋白表达显著提高。与NC组相比,DM患者尿液中整合素β6的表达未出现明显改变,而DKD患者尿液中整合素β6含量显著上升。研究结论整合素β6在db/db小鼠、FN干预的肾小管上皮细胞以及DKD患者尿液中的表达明显增加。当ECM纤维化程度提升时,FN表达水平增加,作用于细胞膜上的整合素β6,激活Fak/Src通路,促进YAP的磷酸化,增加Notch1表达,进而促进肾小管上皮细胞发生EMT。DKD患者尿液中的整合素β6可能作为DKD的潜在生物标志物,而抑制肾小管上皮细胞中整合素β6的表达可能为我们提供预防和临床治疗DKD的新靶点和新思路。第二部分雷公藤甲素对糖尿病肾脏疾病自噬和纤维化的作用及机制研究研究目的DKD作为DM常见的并发症之一,严重威胁人体的健康。自噬是机体通过降解细胞器组分和蛋白以维持细胞内正常新陈代谢的生理过程。DKD模型中ECM明显积聚,肾脏发生纤维化,自噬程序受明显抑制。雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook F,TWHF)是一种提取自中国传统药材雷公藤的药物,常被临床用于治疗DKD等肾脏疾病,并取得良好疗效。然而TWHF导致的肝损伤等不良反应也十分明显。雷公藤甲素(triptolide,TP)是雷公藤的主要活性成分之一。作为一种单纯的化合物,TP是否可以在维持TWHF对蛋白尿良好疗效的同时有效规避这些不良反应尚不明确。本实验旨在探寻TP对DKD的作用效果及作用机制,为临床治疗和预防DKD提供新的思路。研究方法雄性SD大鼠分为标准饮食喂养组(NC)、高脂饮食(high-fat diet,HFD)合并单次链脲佐菌素(streptozocin,STZ)腹腔内注射组(DKD),以及HFD/STZ造模并接受200mg/kg/d TP灌胃治疗组(DKD+TP)。测量实验大鼠的血糖和尿微量白蛋白(urine microalbumin,UMA)。IHC和WB实验评估肾组织切片中纤维化指标Ⅳ型胶原(CollegenⅣ,ColⅣ)、FN以及自噬指标P62、LC3的表达。人肾小球系膜细胞(human renal mesangial cells,HRMCs)分为4组,分别以5.5mmol/L葡萄糖(NG)、5.5mmol/L葡萄糖加19.5mmol/L甘露醇(MA)、25mmol/L葡萄糖(HG)、25mmol/L葡萄糖加10μmol/L TP(HG+TP)干预48h。应用自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)干预细胞或以si RNA技术敲减自噬相关基因(autophagy-related gene,Atg)5,检测纤维化指标的变化,以评估自噬和纤维化的关系。进行mi RNA芯片分析以寻找差异表达的mi RNA,根据Target Scan数据库预测靶基因,荧光素酶报告基因实验进行验证。转染磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologue,PTEN)的si RNA,检测自噬和纤维化指标的改变情况。分别转染mi R-141-3p类似物和抑制物,检测PTEN和下游的蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)表达情况。研究结果1、DKD大鼠血糖水平和UMA水平明显升高。DKD+TP组大鼠UMA水平显著下降,且肝功能及血常规指标未出现明显的统计学差异。DKD大鼠自噬水平显著下降,而DKD+TP组自噬水平明显回升,纤维化得到显著缓解。2、HG干预下的HRMCs中ColⅣ、FN和P62表达明显升高,LC3Ⅱ/Ⅰ比值显著下降,即HG组细胞自噬水平下降,纤维化水平上升。TP干预后,HRMCs自噬水平回升,纤维平水平被显著抑制。3、应用3-MA或Atg-5 si RNA抑制自噬后,ColⅣ、FN表达明显上升,TP对纤维化指标的恢复作用明显受损,提示TP通过恢复细胞自噬而缓解纤维化进程。4、mi RNA芯片分析发现,HG组细胞中mi R-141-3p含量明显升高,而HG+TP组中mi R-141-3p表达明显降低。mi R-141-3p可以直接作用于PTEN的3’UTR区并抑制PTEN的表达。HG+TP组细胞转染PTEN-si RNA后,TP对于HG诱导下自噬和纤维化的恢复作用被显著抑制。5、HG干预的细胞转染mi R-141-3p抑制物后,PTEN表达提升,下游Akt/m TOR通路被抑制,ColⅣ、FN和P62表达下降,LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高,提示自噬水平回升,纤维化程度下降。而转染mi R-141-3p类似物可抑制TP恢复自噬并缓解纤维化的作用。研究结论HFD/STZ造模的DKD大鼠血糖水平和纤维化水平显著上升,自噬水平明显下降。TP治疗减轻DKD大鼠尿蛋白,有效缓解肾组织肥大,恢复自噬水平并缓解肾脏纤维化,且未发现TP对肝功能和血液系统的副作用。高糖干预会引起mi R-141-3p表达升高,进而作用于靶基因PTEN的3’UTR区,抑制PTEN表达,激活下游Akt/m TOR通路,抑制细胞自噬,从而促进纤维化进程。TP抑制mi R-141-3p表达,通过作用于PTEN/Akt/m TOR通路,恢复自噬,进而缓解肾脏纤维化。