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近年来,光热治疗作为一种新兴的肿瘤治疗模式而备受关注。它的基本原理是利用聚集在肿瘤部位的光热材料在近红外光照射下产生光热效应,从而使肿瘤的局部温度达到42℃以上,诱导肿瘤细胞急性坏死、凋亡以及免疫反应,实现消除肿瘤的目的。但光热治疗存在肿瘤消除不完全、热耐受性、易复发等问题。因此,如何克服肿瘤细胞的热耐受性、提高光热治疗效果,是当前研究的一个热点。研究表明,肿瘤细胞受高温刺激后,细胞内的热休克蛋白90(HSP90)会应激性过表达,以降低热作用对细胞的损伤作用,即产生所谓的肿瘤细胞热耐受性,导致光热治疗效果不理想。为了克服肿瘤细胞热耐受性,我们采用HSP90抑制剂17AAG抑制HSP90的应激性过表达,以提高肿瘤细胞对热疗的敏感性,从而提高光热治疗的效果。同时,HSP90也是肿瘤分子靶向治疗的靶点,因此,17AAG对HSP90的抑制作用,可发挥其分子靶向治疗的效果。目的本文围绕实现光热和分子靶向双向协同治疗增强肿瘤治疗效果的目标,构建了共载有机荧光染料Cypate和HSP90抑制剂17AAG的聚合物胶束,探索Cypate在近红外光照射下的光热治疗效果与17AAG的分子靶向治疗的协同作用机制以及两者协同产生的抗肿瘤效果。方法(1)以PEG115-PCL60为载体,采用溶剂透析法将光热治疗药物Cypate与HSP90抑制剂17AAG共包载于胶束内核,构建出具有光热、分子靶向治疗双向协同效应的载药胶束(Cypate/17AAG-Micelles,简称为CA-Micelles)。利用透射电镜等对其进行表征,并考察其在不同介质中的释药行为。(2)以A549细胞为模型,考察了载药胶束的摄取情况及不同条件下的细胞毒性。(3)采用流式细胞术研究CA-Micelles的细胞损伤机制,并通过凝胶电泳考察载药胶束的光热效应和分子靶向治疗作用对肿瘤细胞内相关蛋白表达的影响。(4)建立皮下瘤模型,利用Cypate荧光成像的特点,考察载药胶束的肿瘤靶向性,通过肿瘤组织的热成像和DHE染色验证其光热和光动力效果。(5)建立皮下瘤模型,研究载药胶束的抗肿瘤活性,并对其安全性进行了初步评价。结果(1)制备了载Cypate/17AAG的自组装胶束,其平均粒径为60 ± 10 nm,大小均一,分散性好。Cypate和17AAG在胶束中载药量分别为14.6%、1.6%。胶束的包载可明显提高Cypate的光热转换效率,从而增强其光热升温效果。在酸性(pH 5.0)条件下,该胶束的释药量增多,具有明显的酸性响应性释药特性,有利于发挥分子靶向治疗作用。(2)体外细胞实验结果显示:与游离的药物相比,CA-Micelles更容易被摄取进入细胞,有效提高Cypate和17AAG的细胞摄取量。内吞途径研究表明,该胶束主要通过网格蛋白介导的内吞途径摄取进入溶酶体。在近红外光照射下,胶束中的Cypate产生了明显的光热效应以及单线态氧;前者能诱导显著的光热细胞损伤坏死作用,而单线态氧能通过光化学内化作用诱导溶酶体膜的破裂,进而促进载药胶束的胞浆转运。(3)Western blot实验结果表明,在近红外光照射下,细胞内HSP90会应激性过表达,而载药胶束中17AAG可与HSP90特异性结合,从而影响其下游相关蛋白表达,诱导细胞凋亡,产生协同细胞损伤作用。(4)近红外荧光成像结果表明,CA-Micelles具有良好的肿瘤靶向性;肿瘤热成像实验和DHE染色实验显示,该胶束能在肿瘤部位产生显著的光热效应和单线态氧。(5)抑瘤实验表明,CA-Micelles在A549皮下瘤模型上可以产生显著的光热和分子靶向双向协同抑瘤效果,而对正常组织不会造成明显的急性损伤。结论载Cypate/17AAG自组装胶束制备工艺简单,载药量高,对肿瘤具有良好的靶向性。在近红外光照射下,该胶束可促进17AAG的胞浆转运,增强其分子靶向治疗作用;同时,17AAG可通过抑制HSP90热应激性过表达,降低肿瘤细胞的热耐受性,从而增强Cypate的光热治疗作用,最终实现光热、分子靶向双向协同抑瘤效果。上述研究表明,这种双向协同治疗的载药胶束是一种很有潜力的载药系统,为肿瘤的协同治疗提供了一种新策略。