斑马鱼卵黄原蛋白受体的功能分析

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在大多数卵生动物中,卵子发生和卵黄发生构成了卵巢发育的基本过程,卵黄发生其本质就是卵黄蛋白(yolk proteins,YPs)等物质在卵母细胞中的大量积累,为早期胚胎发育提供养分和能量。卵黄原蛋白(vitellogenin,VTG)是一种磷脂糖蛋白,是为胚胎发育所必需的储存营养物质的卵黄蛋白的前体。卵黄发生时,雌激素会刺激VTG在肝脏中生成,分泌到血液后进入循环系统,通过卵黄原蛋白受体(vitellogenin receptor,VTGR)介导的内吞作用进入卵母细胞,经裂解后生成多个卵黄蛋白并存储在卵母细胞胞质内。该过程中,VTGR是卵母细胞吸收VTG等营养物质的关键,在卵母细胞和胚胎发育中起着关键作用。近几年的相关研究表明,在卵生动物中,VTGR结构保守,均属于低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDLR)家族。前人和我们前期的大量研究已表明,在鱼类中存在的两种主要候选者,一种是低密度脂蛋白受体(very low density lipoprotein receptor,VLDLR),另一种为LRP13。然而VLDLR和LRP13在卵黄发生中的功能仍然缺乏研究,缺乏在体的实验证据。本论文以斑马鱼为研究对象,从基因结构、表达定位、VTG结合属性和基因敲除等角度,全方位探究VLDLR和LRP13在卵黄发生中的功能。1.进化树以及蛋白结构域分析结果表明vldlr、lrp13a和lrp13b三种基因编码的蛋白均属于LDLR家族,其蛋白具有LDLR蛋白的保守结构域,包括配体结合结构域、表皮生长因子前体同源结构域等。2.利用原位杂交技术,分析了lrp13a和lrp13b这两个基因在卵巢中的表达定位。两种基因均在卵巢内较小的卵泡中,即在早期生长期(primary growth stage,PG)和卵黄生成前期(previtellogenic,PV)卵母细胞的胞质内表达。3.通过酵母双杂交技术,系统分析了三种受体VLDLR、LRP13a和LRP13b与VTG结合的属性。通过和斑马鱼中存在的8种不同VTG蛋白的结合实验分析,表明VLDLR与任何一个VTG均不结合,LRP13a分别与VTG1、VTG2和VTG3相互结合,LRP13b分别与VTG1、VTG2和VTG5相互结合。4.利用CRISPR/Cas9技术对vldlr、lrp13a和lrp13b分别进行了基因敲除,成功构建了vldlr、lrp13a和lrp13b三种基因敲除系,分别对它们所产胚胎的大小、数量等进行统计,并拍照记录胚胎发育过程。发现vldlr、lrp13a和lrp13b的敲除对所产胚胎大小、数量以及胚胎存活率均有影响。5.对三种基因敲除纯合系鱼进行性腺组织切片。发现三种基因敲除后,其纯合子卵巢的发育有明显的延迟,并且出现性逆转现象。综上所述,我们在斑马鱼的系统分析表明两种LRP13受体包括LRP13a和LRP13b是卵黄原蛋白受体,但VLDLR是否为卵黄原蛋白受体需要进一步分析。
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