论文部分内容阅读
目的： 骨骼肌成肌细胞移植治疗心梗为病人带来了希望，但在移植治疗过程中，心肌组织缺血缺氧环境下出现的氧化应激会导致移植细胞的凋亡，严重影响治疗效果。本实验拟建立体外L6骨骼肌成肌细胞(L6 Skeletal Myobalst,L6SKM)H2O2 损伤模型，过表达和抑制 microRNA-214 (miR-214)，研究在氧化应激条件下成肌细胞的凋亡变化并探讨其调控机制。 方法： 细胞接种于6孔板中，制备细胞爬片或接种于培养瓶中，24h后进行miR-214转染，转染后继续孵育24小时，然后300μmol/L H2O2作用4h。实验分六组：H2O2组、正常对照组、miR-214前体+ H2O2组(pre-miR-214+ H2O2组)、miR-214前体空白+ H2O2组(pre-scramble+ H2O2组)、miR-214抑制剂+ H2O2组(anti-miR-214+H2O2组)、miR-214抑制剂空白+H2O2组(anti-scramble+H2O2组)。倒置显微镜下观察细胞的形态，SP法检测细胞色素C(Cytochrome C，cyt-c)表达；DAPI染色显示miR-214对H2O2损伤L6SKM细胞凋亡的影响；Western blotting法检测各组PTEN的表达。流式细胞仪检测以上各组及加入人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，pten)抑制剂组后L6SKM的凋亡率。 结果： 1. miR-214对H2O2损伤L6SKM细胞生长及凋亡的影响 显微镜下显示，正常组L6SKM生长旺盛，cyt-c免疫染色显示细胞质中可见散在点状的棕黄色颗粒，分布均匀。细胞核为圆型或椭圆形，染色质分布均匀;H2O2组细胞生长缓慢，部分 L6SKM 皱缩，细胞间隙增宽。cyt-c 阳性呈弥漫性片状分布，表达明显高于对照组，部分细胞出现异染色质边集或碎裂，凋亡细胞数目明显增加；pre-miR-214+H2O2组的L6SKM生长状态明显好于H2O2处理组，cyt-c 表达明显低于 H2O2组，而细胞凋亡率明显低于H2O2组；anti-miR-214+H2O2组细胞生长状态明显不如H2O2处理组，细胞固缩死亡数目增加。Cyt-c表达明显高于H2O2组。DAPI显示凋亡率也高于H2O2组。 2. miR-214对H2O2损伤L6SKM中PTEN蛋白表达的影响 Western bolt检测显示，H2O2处理引起PTEN表达明显增高，而与H2O2组相比，miR-214的过表达显著降低了PTEN表达，抑制miR-214的表达使PTEN表达显著升高。 3. 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率 H2O2组细胞凋亡率(39.47±1.89)明显高于对照组(7.55±0.42)，P＜0.05；pre-miR-214+H2O2 组细胞凋亡率(18.57±0.97)明显低于 H2O2 组(39.47±1.89)，P＜0.05；anti-miR-214+H2O2细胞组(41.16±2.21)略高于H2O2组，无统计学意义，但其晚期凋亡率相对明显升高；pre-miR-214+ pten inhibitor +H2O2组细胞凋亡率(11.12±0.95)显著低于pre-miR-214+H2O2组(18.57±0.97)，P＜0.05；anti-miR-214+ pten inhibitor +H2O2组细胞凋亡率(17.63±0.73)显著低于anti-miR-214+H2O2组(41.16±2.21)，P＜0.05。 结论： 1. miR-214过表达可以抑制过氧化氢诱导成肌细胞凋亡。 2. miR-214通过下调PTEN，增强PI3K/Akt信号通路活性，达到抑制细胞凋亡的作用。