【摘 要】
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研究背景结直肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤。近些年,在我国,结直肠癌的发病率和病死率的趋势不断上升。中药的抗肿瘤作用及药物开发利用研究是近些年的研究热点。小檗碱,又称黄连素,是一种异喹啉类生物碱,是中药黄连主要有效成分,临床上用于腹泻和胃肠炎疾病。近些年有研究表明,小檗碱对包括结直肠癌在内的多种癌症有良好的抗肿瘤活性,然而其分子机制尚不清楚。长链非编码RNA是生物生命活动和疾病的重要调控因子。众多研
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研究背景结直肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤。近些年,在我国,结直肠癌的发病率和病死率的趋势不断上升。中药的抗肿瘤作用及药物开发利用研究是近些年的研究热点。小檗碱,又称黄连素,是一种异喹啉类生物碱,是中药黄连主要有效成分,临床上用于腹泻和胃肠炎疾病。近些年有研究表明,小檗碱对包括结直肠癌在内的多种癌症有良好的抗肿瘤活性,然而其分子机制尚不清楚。长链非编码RNA是生物生命活动和疾病的重要调控因子。众多研究表明Wnt/β-catenin信号通路在肿瘤等众多疾病的形成与发展过程中同样发挥着重要作用。我们前期的研究也发现中药的抗肿瘤作用与lncRNAs和Wnt信号通路密切相关。因此从表观遗传学学角度来研究小檗碱对结直肠癌的生物学功能的影响及分子机制至关重要。研究目的探究体内外小檗碱对结直肠癌的抗肿瘤作用,对其机制从表观遗传学角度进行研究。为小檗碱抗结直肠癌作用的分子机制提供基础理论支持。研究方法1、用MTT法、克隆形成实验、流式分析来检测小檗碱对结直肠癌细胞增殖、细胞周期与凋亡的影响。2、用qRT-PCR和Western blot来检测给药后对结直肠癌细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响,并且筛选出给药后表达量变化明显的lncRNA。3、通过构建lincROR过表达的稳转细胞株细胞与转染lincROR的siRNA,来检测过表达和敲低lincROR对结直肠癌细胞增殖能力及Wnt/β-catenin信号通路的影响。4、建立裸鼠移植瘤模型,进行体内实验验证小檗碱和lincROR对结直肠癌肿瘤形成的影响。用免疫组化、免疫荧光检测瘤体β-catenin与细胞增殖标志物Ki-67的表达。5、通过qRT-PCR与双荧光素酶报告基因实验验证lincROR和miR-145的直接结合作用。并检测增强或抑制miR-145后对细胞增殖、Wnt/β-catenin信号通路的影响。6、用生物信息学软件miRcode预测miR-145的靶基因,并通过双荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR、Western blot验证miR-145与其靶基因WNT2B、WNT10A的结合调控作用。细胞过表达lincROR后共转染miR-145 mimics或inhibitor验证lincROR通过miR-145对靶基因WNT2B、WNT10A与Wnt/β-catenin信号的影响。研究结果1、小檗碱抑制了结直肠癌细胞的增殖,诱导了细胞周期阻滞和凋亡并抑制了细胞的Wnt/β-catenin信号通路。2、小檗碱明显抑制了结直肠癌细胞中lincROR的表达,并且过表达lincROR会逆转小檗碱对结直肠癌细胞增殖与Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用。此外,敲低lincROR会抑制结直肠癌细胞的增殖与Wnt/β-catenin信号通路。3、体内实验中,小檗碱明显抑制了裸鼠肿瘤的形成。lincROR过表达组则逆转这种抑制。4、双荧光素酶报告基因实验证实了 lincROR可与miR-145直接结合,miR-145会降低lincROR的表达,且lincROR负调控miR-145的表达。5、增强miR-145会降低结直肠癌细胞的增殖,miR-145是结直肠癌细胞的负调控因子并抑制Wnt/β-catenin信号通路。6、双荧光素酶报告基因实验证实了 miR-145可与WNT2B/WNT10A直接结合,增强miR-145则明显降低细胞的WNT2B/WNT10A的表达,抑制Wnt/β-catenin信号通路。7、增强 miR-145 明显逆转 lincROR 对 WNT2B/WNT10A 表达、Wnt/β-catenin 信号通路的促进作用;抑制miR-145明显加强lincROR对WNT2B/WNT10A表达、Wnt/β-catenin 信号通路的促进作用。研究结论小檗碱可通过lincROR/Wnt/β-catenin轴抑制结直肠癌细胞增殖;miR-145通过靶向作用 WNT2B/WNT10A 调控 Wnt/β-catenin 信号通路;lincROR 通过 miR-145 调控WNT2B/WNT10A的表达来激活Wnt/β-catenin信号通路。因此小檗碱可通过lincROR调控miR-145/WNT2B/WNT10A/Wnt/β-catenin信号轴,在体内外抑制结直肠癌细胞的增殖。
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