论文部分内容阅读
牛病毒性腹泻(Bovineviraldiarrhea,BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起的,主要侵害牛、羊、鹿、牦牛等反刍动物及猪的一种重要传染病。该病的隐性感染以持续感染和免疫耐受为特点,持久带毒、排毒,成为常在传染源,是造成BVDV广泛传播的重要因素。随着高产奶牛的大量引进,新疆奶牛BVDV感染严重,尤其是隐性感染所造成的危害不被人所知。因此,本研究从隐性感染的分子流行病学出发,分析新疆BVDV主要流行株和系统进化关系,从而对BVDV的防疫做到有的放矢,最终获得可靠的免疫效果。
本实验以RT-PCR技术为研究方法,参照多株不同基因型和基因亚型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5UTR相对保守的基因序列,设计3对引物,其中外侧引物F1F2能够扩增不同基因型BVDV5UTR片段(288bp),内侧引物P1P2和P3P4分别能够扩增BVDV-1型和BVDV-2型5UTR片段(195bp和116bp)。经过对PCR反应条件进行优化,建立了一种特异、敏感的巢式RT-PCR检测方法,敏感性为10-3TCID50/100μL。对猪瘟兔化弱毒疫苗株、牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒的检测结果均为阴性。本方法即用于基因分型又可区别其它瘟病毒属成员,大大提高了灵敏性和特异性,能够快速、简便、高特异性和高灵敏度的诊断BVDV感染的奶牛。
应用已建立的巢式RT-PCR检测方法对采自新疆4个不同地区8个牛场的302份全血样品进行核酸检测及测序。结果表明:BVDV平均阳性率为43.39%。其中有101对为母子对应样品,母牛BVDV感染率为44.89%,犊牛BVDV感染率为56.19%,数据显示犊牛比母牛易感。测序得到27条序列,经核酸序列同源性比较和系统发生分析表明,26株病毒与VEDEVAC亲缘关系最近,同源性达96.2-100%,属于BVDV-1b基因亚型,只1株为BVDV-1c亚型,未检测到BVDV-2型。提示新疆BVDV流行株为BVDV-1b亚型,同时有BVDV-1c亚型共存。
应用BVDV的生物型检测方法对27个已经测序的BVDV阳性样品鉴定生物型。接种于MDBK细胞,观察其是否发生细胞病变。结果表明:所有27个BVDV分离株都表现为ncp型,表明新疆BVDV分离株主要为ncp型。有关报道表明,这种生物型是分离株中最普遍的,而且以病毒的垂直传播为特点。所分离的27株病毒中有8对为母子对应样品,提示其犊牛发病可能由垂直感染引起。通过以上研究表明,新疆BVDV主要流行株为BVDV-1b亚型,同时BVDV-1c亚型共存,且都为ncp型病毒。