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目的本研究通过建立多巴胺能神经元体外模型(SH-SY5Y),采用相关生物学技术,观察百草枯(Paraquat,PQ)对多巴胺能神经元自噬功能的影响;探讨高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)和α-突触核蛋白(α-synuclein)是否为PQ影响神经元自噬功能的贡献因子;最后阐明HMGB1通过调控α-synuclein表达参与多巴胺能神经元自噬抑制的机制。方法选取人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)作为多巴胺能神经元的体外模型,不同浓度PQ处理细胞24 h以及150μmol/L PQ处理细胞不同时间,CCK8法检测PQ对SH-SY5Y细胞增殖活性的影响;分光光度法检测细胞上清中LDH的活力;免疫印迹法(Western blot)检测PQ处理后细胞内自噬相关蛋白(LC3I、LC3II、Beclin1、Vps34、p62)、α-synuclein和HMGB1蛋白表达水平;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测α-synuclein和HMGB1基因表达水平;单丹磺酰尸胺(MDC)染色法检测细胞内自噬小体的变化;免疫荧光法(Immunofluorescencetechnique,IF)检测α-synuclein和HMGB1表达水平及其位置变化;自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)100 nmol/L预处理细胞6 h后,Western blot检测处理前后细胞内自噬相关蛋白及α-synuclein的蛋白表达水平;免疫共沉淀法(Co-Immunoprecipitation,Co-Ip)检测HMGB1与Beclin1及α-synuclein之间的相互作用;转染HMGB1 shRNA慢病毒及过表达HMGB1慢病毒到SH-SY5Y细胞中,采用Western blot法及IF法探究HMGB1对α-synuclein及自噬相关蛋白表达水平的影响。结果(1)PQ诱导多巴胺能神经元自噬功能的影响:PQ呈剂量依赖性和时间依赖性抑制SH-SY5Y细胞的增殖活性(P<0.05);PQ处理组细胞上清中LDH活力明显升高(P<0.05);Western blot结果显示,与PQ处理组细胞内自噬相关蛋白(LC3II/LC3I比值)、Beclin1和Vps34蛋白表达水平明显下降(P<0.05),p62蛋白表达水平升高(P<0.05);MDC染色结果显示,PQ处理组,细胞内自噬小体形成明显减少(P<0.05);RAPA干预后,自噬相关蛋白LC3II/LC3I、Beclin1和Vps34蛋白表达水平明显升高(P<0.05),p62蛋白表达水平无明显变化,α-synuclein蛋白表达水平明显下降(P<0.05);IF结果显示,RAPA干预后,α-synuclein表达水平明显降低(P<0.05);(2)α-synuclein和HMGB1是参与PQ诱导多巴胺能神经元自噬异常的关键因子:qRT-PCR结果显示,PQ处理组α-synuclein和HMGB1基因表达水平明显增加;Western blot结果显示,PQ处理组α-synuclein和HMGB1蛋白表达水平均明显升高(P<0.05);IF结果显示,PQ处理组α-synuclein和HMGB1表达水平均明显增加,α-synuclein免疫荧光信号明显增强并有核周聚集趋势,HMGB1发生胞质易位,且α-synuclein与HMGB1共定位程度增加;Co-Ip结果显示,与对照组比较,经PQ处理后,HMGB1与Beclin1解离,HMGB1与α-synuclein结合(P<0.05)。(3)HMGB1通过调控α-synuclein表达参与多巴胺能神经元自噬抑制:Western blot结果显示,沉默HMGB1后α-synuclein蛋白表达水平降低(P<0.05),自噬相关蛋白表达水平下降,p62蛋白表达水平增高(P<0.05);过表达HMGB1后,α-synuclein蛋白表达水平增高(P<0.05),自噬相关蛋白表达水平明显下降(P<0.05),p62蛋白表达水平增高(P<0.05);IF结果显示,沉默HMGB1后α-synuclein和HMGB1荧光强度均减弱,其共定位程度降低;LC3表达量减少,荧光强度减弱;过表达HMGB1组细胞内α-synuclein和HMGB1表达水平均明显增加,HMGB1发生胞质易位,且α-synuclein与HMGB1共定位程度增加;LC3表达量减少,荧光强度减弱。结论在多巴胺能神经元的体外模型中,PQ诱导多巴胺能神经元自噬功能障碍,且α-synuclein和HMGB1是参与PQ诱导多巴胺能神经元自噬异常的关键因子,HMGB1通过与α-synuclein结合参与PQ诱导的多巴胺能神经元自噬功能障碍,抑制异常聚集α-synuclein的自噬性降解。