[研究背景和目的]系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一种累及多系统、多器官的全身性自身免疫病,以大量自身抗体产生、补体激活和免疫复合物沉积为主要特征,临床上可导致各个系统和器官损伤,常见的如严重的肾小球肾炎。目前其病因和发病机制尚未完全阐明,当前并无特异性的治疗方法。SLE小鼠模型的研究对于探索人类SLE的病因、发病机制和寻找新的治疗方法等方面都有着非常重要的意义。目前系统性红斑狼疮的小鼠模型主要分为自发性小鼠模型、基因调控性小鼠模型和人工诱导性小鼠模型3种,其中自发性小鼠模型的狼疮是在自然情况下发生的,与人类的狼疮更加相似。现国内外研究比较充分的自发性小鼠模型主要有MRLMpr-lpr/lpr (MRL/lpr)、NZB/NZW F1(NZB/WF1)和BXSB/Yaa三种品系。MRL/lpr小鼠由LG/J、AKRA/J、C3H/Di及C57BL/6不同品系小鼠经过复杂交配至第12代时产生,由于lpr基因突变,功能性的Fas抗原缺失,自身反应T细胞大量进入外周,造成MRL/lpr小鼠产生淋巴结肿大、肾小球肾炎、血管炎和关节炎,并且有特征性类风湿因子、免疫复合物和抗dsDNA自身抗体的产生；目前的研究发现雌性MRL/lpr小鼠比雄性小鼠发病早。NZB/WF1小鼠是NZB (New Zealand Black)和NZW (New Zealand White)的杂交一代,能发生严重的自身免疫病,其亲代则不发生自身免疫病。研究发现雌性NZB/W F1小鼠比雄性鼠发病早,与人类SLE的发病相似,50%的雌性小鼠于5-6月龄产生自身抗体,最终在8-9月龄时死于肾衰竭,而雄性鼠一般在15月龄时死亡.BXSB/Yaa小鼠由雌性C57BL/6和雄性SB/Le杂交而来,属于重组近交系小鼠,能自发地出现SLE样的自身免疫综合征。虽然雌性和雄性鼠都会死于致命的肾小球肾炎,但雄性鼠比雌性鼠发病早,与人类SLE的发病正好相反。50%的雄性鼠死于5月龄时,而雌性鼠则发生在15月龄时。SLE患者的免疫异常以T、B淋巴细胞的高度活化和功能异常最为突出。T淋巴细胞是免疫应答中起核心作用的免疫细胞,具有细胞免疫和免疫调节功能。T细胞可分为功能不同的几个亚群,包括辅助性T细胞(Thelp cells, Th)、抑制性T细胞(Suppressor T cells, Ts)、效应T细胞(Effector T cells, Te)、细胞毒性T细胞(Cytotoxic T cells, Tc)和迟发性变态反应T细胞(Delayed type hypersensitivity T cells, Td)等。正常免疫应答需要所有T细胞亚群的功能处于一种平衡状态。T细胞亚群功能异常、分布不均衡和不同亚群的活化对SLE发生起重要作用。近年来研究发现Th细胞及其产生的细胞因子在SLE及其它自身免疫疾病的发病过程中发挥着重要作用。Th细胞通过诱导或抑制其它免疫细胞增殖、分化和活化,从而调节免疫反应。Th细胞因其表面表达CD4又被称为CD4+T细胞。Th细胞不是单一的细胞群,初始CD4+T细胞可以分化为Th1、Th2、调节性T细胞(Regulatory T cell, Treg)和Th17亚群,这些Th细胞分泌的细胞因子以及发挥的免疫作用有所区别。IL-12.IL-18促进初始CD4+T细胞分化成Th1细胞,Th1细胞分泌IFN-γ、IL-2、TNF-β等因子,这些细胞因子称为Th1型细胞因子；Th1细胞主要介导细胞免疫,参与巨噬细胞活化,刺激细胞毒T细胞的增殖和分化,迟发型变态反应。IL-4促进初始CD4+T细胞分化成Th2细胞,Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等因子,这些细胞因子称为Th2型细胞因子；Th2细胞主要介导体液免疫,促进B细胞增殖分化、嗜酸粒细胞活化和IgE抗体生成。TGF-p促进初始CD4+T细胞分化成Treg细胞,其分泌IL-4、IL-10和TGF-p等细胞因子,Treg细胞能够维持免疫自稳,抑制免疫应答。IL-6、TGF-β促进初始CD4+T细胞分化成Th17细胞,其分泌IL-17、IL-22、IL-21、IL-6和TNF-a等,Th17细胞促进免疫炎症发生。近年来研究认为T细胞分泌的细胞因子之间的失衡对SLE发生起重要作用,其中Th1/Th2失衡在SLE中起着决定性的作用,但研究表明SLE细胞因子分泌异常的表现并不一致,科研工作者提出了不同的假说：“Thl优势”和“Th2优势”。“Th1优势”源自SLE动物模型,Huang FP和Reychler G等研究发现Thl型细胞因子在MRL/lpr小鼠的狼疮样自身免疫性疾病的发生发展中有重要的作用；Prud’homme GJ等发现BXSB狼疮小鼠的脾脏主要是Th1型细胞因子——IFN-γ的增加；对NZB/W F1狼疮鼠的研究发现,治疗性注射IFN-γ可促进SLE发病,加重病情,增加自身抗体产生,而抗IFN-γ抗体或可溶性IFN-γ受体可预防SLE的发生,缓解病情,减少自身抗体产生；上述研究均提示Thl型细胞因子IFN-γ对狼疮小鼠模型疾病发生发展有重要意义。然而,Th2型细胞因子引起的反应在SLE的发生发展中也起一定的作用,Medide等证实,在BXSB/Yaa狼疮小鼠和北帕默斯顿鼠狼疮模型,Th2型细胞因子IL-4占优势。动物实验中,抗IL-4抗体可抑制IgG型dsDNA抗体的产生,并减少狼疮肾炎的发生。在NZB/W F1和MRL-Fas小鼠,用IL-4受体或抗IL-4单克隆抗体,可减少自身抗体产生,并可抑制蛋白尿和肾小球肾炎的发生,改善肾脏功能,使动物生存时间延长。此外IL-13也是一种Th2型细胞因子,对于SLE患者,IL-13可直接使天然B细胞产生IgG4和IgE,并且诱导类风湿因子抗体的产生。Th17细胞是新近发现的一种Th细胞的亚型,主要分泌IL-17,Th17还分泌IL-21、IL-22等多种细胞因子。Th17细胞与SLE发病过程有着密切的关系。BXSB/Yaa小鼠模型发现IL-21水平明显增高；Herber等研究表明阻断IL-21/IL-21R通路可显著缓解MRL/lpr狼疮鼠病情。研究发现MRL/lpr小鼠可分泌IL-13和IL-17,但关于NZB/W F1和BXSB/Yaa、鼠会否分泌IL-13和IL-17还未可知。狼疮病人肾脏浸润T细胞主要为Th1、Th2和Th17,但各细胞亚群的具体作用还不清楚。激光微切割(Laser microdissection, LMD)是目前分离单个细胞和特定组织成分的非常有效的技术,它利用激光的作用,从切片中分离特异性结构或细胞以及细胞器。细胞技术、核酸分析技术和蛋白分析技术与激光微切割相结合,可以对特异性结构或细胞进行基因水平和蛋白水平的研究。RT-PCR与LMD相结合,可对复杂的正常和病变组织中特定细胞群进行遗传变异、基因表达和蛋白表达的研究。本课题主要以MRL/lpr、NZB/W F1和BXSB/Yaa三种狼疮小鼠为研究对象,应用免疫组织化学技术,分析3种狼疮小鼠模型肾脏T细胞的种类和特性,利用LMD技术切取狼疮小鼠模型肾脏肾小球和肾血管周围区,应用RT-PCR技术检测IL-10、IL-13、IL-17和IFN-γ的表达情况,分析这4种细胞因子在3种SLE小鼠模型发病中作用,确定Th1、 Th2和Th17三种CD4+T细胞在狼疮鼠发病中的地位,同时对找到SLE新生物学标记和治疗靶点提供依据。[方法]1.狼疮小鼠模型肾脏的组织和细胞特性分析：选用MRL/lpr、NZB/WF1和BXSB/Yaa三种狼疮小鼠模型,HE染色确定肾小球肾炎和血管炎的形成,应用免疫组织化学方法检测肾脏L3T4、Ly-2、B220和Thy-1的表达(我看到文章后边没有L3T4、Ly-2的内容,也没有这两个东西的分析),分析CD4细胞、CD8细胞、CD45R和T细胞在不同狼疮小鼠模型肾脏的分布和特性。2.狼疮小鼠模型肾脏细胞因子基因表达的分析：应用LMD技术切取3种狼疮小鼠模型肾脏肾小球和肾血管周围区,应用RT-PCR技术检测IL-10、IL-13、IL-17和IFN-γ的表达情况,分析4种细胞因子在三种SLE小鼠发病中作用。[结果]1.HE染色观察结果：10只雌性MRL/lpr小鼠和9只雌性NZB/W F1小鼠均形成肾小球肾炎和血管炎,10只雄性BXSB/Yaa小鼠形成肾小球肾炎。在雄性BXSB/Yaa小鼠的肾脏血管周围组织并未观察到细胞浸润。2.免疫组织化学：在MRL/lpr、NZB/W F1和BXSB/Yaa三种模型小鼠的肾小球均检测到Thy-1、B220、CD4和CD8,尤其在MRL/lpr小鼠的肾小球周围区域。这表明T细胞浸润的主要部位在肾小球周围。在MRL/lpr和NZB/W F1模型小鼠的肾脏血管周围组织也观察到Thy-1、B220、CD4和CD8的存在。在肾小球和肾脏血管周围组织Thy-1阳性区域大于B220、CD4和CD8阳性区域。3.激光微切割和RT-PCR分析：冰冻切片的肾小球通过激光微切割技术,从切片下切割下来,并进行了收集。切割下的肾小球无肾小管或其它组织污染。10只MRL/lpr小鼠,切割292个肾小球和血管周区域β-actin和TCR-Cβ表达阳性；9只NZB/WF1小鼠,切割315个肾小球和血管周区域β-actin和TCR-Cβ表达阳性；10只BXSB/Yaa小鼠,切割188个肾小球和血管周区域β-actin和TCR-Cβ表达阳性；在MRL/lpr、NZB/W F1和BXSB/Yaa三种模型小鼠的T细胞浸润的肾小球和血管周围区域主要产生IFN-γ、IL-13和IL-17。BXSB/Yaa小鼠肾小球表达IL-17的细胞数量低于MRL/lpr和B/WF1小鼠。在NZB/W F1小的肾小球病变区域,48.6%T细胞的表达IFN-y,这显著低于BXSB/Yaa小鼠(66.4%,P<0.05)和MRL/lpr小鼠(63.1%,P<0.05)在MRL/lpr、NZB/W F1和BXSB/Yaa三种模型小鼠的肾小球病变区域,T细胞IL-13阳性表达百分比分别为68.0%、63.3%和63.5%。在MRL/lpr和NZB/W F1模型小鼠的肾小球病变区域,T细胞IL-17阳性表达百分比分别为50.7%和60.8%,这显著高于BXSB/Yaa小鼠的29.7%(P<0.05)。与肾小球浸润T细胞相似,在MRL/lpr和NZB/W F1模型小鼠的肾血管周围区域浸润T细胞也高表达IFN-γ、IL-13和IL-17。此外在MRL/lpr和NZB/W F1模型小鼠的肾血管周围区域浸润T细胞也高表达IL-10。在MRL/lpr小鼠,T细胞IFN-γ和IL-13阳性表达百分比均高于60%,分别为66.9%和72.5%,在NZB/WF1模型小鼠分别为60.2%和61.6%. MRL/lpr和NZB/W F1模型小鼠肾血管周围区域浸润T细胞IL-17阳性表达百分比分别为41.7%和56.6%。MRL/lpr和NZB/W F1模型小鼠IL-10阳性表达百分比分别为64.4%和49.7%。[结论]1.雌性MRL/lpr小鼠和雌性NZB/W F1小鼠均形成肾小球肾炎和肾血管炎,雄性BXSB/Yaa小鼠只形成肾小球肾炎,而未形成肾血管炎。2.在三种狼疮模型小鼠,T细胞浸润的主要部位在肾小球,该区域T细胞主要表达IFN-γ、IL-13和IL-17；在MRL/lpr和NZB/W F1小鼠的肾血管周围区也有T细胞的浸润,其主要表达IFN-γ、IL-13、IL-17和IL-10.3.免疫细胞因子的平衡是非常复杂的,特别是T细胞亚群比例,但不能简单的归咎于体内Th1/Th2细胞之间比例失衡。Th17细胞在狼疮鼠模型中有着十分重要的作用,可能在对MRL/lpr和NZB/W F1模型小鼠的疾病进展中的作用大于BXSB/Yaa小鼠。这些发现将为理解肾小球肾炎和肾血管炎的不同分子机制提供有力的支持。