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背景:骨骼肌失神经支配后,蛋白质合成与分解的平衡被打破,其中,蛋白水解途径的过度激活是引起骨骼肌萎缩的重要因素,而泛素化蛋白酶体途径和自噬-溶酶体途径发挥了重要作用。肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)作为一种关键的E3泛素连接酶,参与调控骨骼肌的分化、发育、萎缩以及再生,在多种条件诱导的骨骼肌萎缩过程中发挥重要作用。micro RNA(miRNA)参与多种因素诱发的骨骼肌萎缩,本课题组通过基因芯片结果结合生物信息学分析发现miR-125b-5p可能对TRAF6发挥潜在的调节作用。本课题拟采用营养剥夺诱导C2C12肌管萎缩以及大鼠失神经肌萎缩模型,研究TRAF6在肌萎缩过程中对泛素化蛋白酶体水解系统以及自噬-溶酶体水解系统的影响,阐明其通过蛋白降解途径调控失神经肌萎缩的具体机制,并深入探讨miR-125b-5p通过靶向抑制TRAF6发挥对失神经肌萎缩的保护作用及机理,为临床防治失神经肌萎缩提供新的靶点。第一部分:TRAF6参与蛋白质降解调控失神经肌萎缩目的通过体内外实验阐明TRAF6参与失神经肌萎缩过程所调控的重要靶分子及其参与的具体途径,为失神经肌萎缩的分子调控机制增添新的内容。方法1.制备体外营养剥夺诱导的肌管萎缩模型,通过免疫组化显示肌管萎缩形态变化;采用Western blot方法检测TRAF6在肌管萎缩不同时间点的表达变化,检测泛素化蛋白酶体水解系统相关蛋白以及自噬-溶酶体水解系统相关蛋白的表达变化。2.制备大鼠坐骨神经离断模型,分别于术后3天、7天、14天和28天取胫前肌,称量分析湿重比;通过免疫组化分析胫前肌肌纤维横截面积的变化;通过透射电子显微镜观察分析胫前肌超微结构的变化;采用RT-q PCR以及Western blot方法检测TRAF6在失神经后不同时间点的表达变化,检测泛素化蛋白酶体水解系统相关蛋白及自噬-溶酶体水解系统相关蛋白的表达变化。3.构建TRAF6敲降的慢病毒载体,于大鼠坐骨神经离断后术侧胫前肌采用多点注射,对照组注射control-sh RNA,术后14天取胫前肌,称量分析胫前肌的湿重比;采用RT-q PCR以及Western blot方法检测慢病毒干扰组与对照组TRAF6的表达;通过免疫组化分析胫前肌肌纤维截面积的变化;通过透射电子显微镜观察分析胫前肌超微结构;采用Western blot检测泛素化蛋白酶体水解系统相关蛋白以及自噬-溶酶体水解系统相关蛋白的表达变化。结果1.营养剥夺后,C2C12肌管直径逐渐减小;TRAF6表达逐渐上调;泛素化蛋白酶体水解系统相关蛋白表达逐渐上调;自噬-溶酶体水解系统相关蛋白表达逐渐上调。2.胫前肌的湿重比随着失神经支配时间的延长逐渐降低;胫前肌肌纤维截面积也随着失神经支配时间的延长逐渐减小。对照组肌纤维超微结构中可见肌丝结构清晰、排列整齐,肌节较宽,肌细胞器中线粒体、肌细胞核等结构未见异常。随着失神经支配后时间的延长,胫前肌肌丝肌节排列紊乱,线粒体形态不规则,空泡化严重,存在空泡结构的线粒体数量也逐渐增多。3.失神经支配后靶肌中TRAF6表达逐渐上调;泛素化蛋白酶体水解系统相关蛋白表达上调;自噬-溶酶体水解系统相关蛋白表达上调。4.TRAF6-sh RNA注射组的胫前肌湿重比以及肌纤维截面积均大于阴性对照组。与对照组相比,TRAF6-sh RNA注射组的肌原纤维中线粒体空泡状态得到缓解,肌小节形态更加完整。5.与阴性对照组相比,TRAF6-sh RNA注射组泛素化蛋白酶体水解系统相关蛋白表达下调;自噬-溶酶体水解系统相关蛋白表达下调。结论1.TRAF6在营养剥夺引起的C2C12肌管萎缩以及失神经肌萎缩过程中表达上调,并且引起肌肉特异性E3泛素连接酶Mu RF1和MAFbx的表达上调,同时激活自噬-溶酶体水解系统相关蛋白Atg7,Beclin1,Bnip3,Pink1,LC3B的表达。2.抑制TRAF6可以缓解失神经肌萎缩,该现象的产生可能是通过进一步抑制泛素蛋白酶体水解系统关键蛋白以及自噬-溶酶体水解系统相关蛋白表达来实现的。第二部分:miR-125b-5p靶向TRAF6缓解失神经肌萎缩目的1.探讨是否存在TRAF6上游调控因子,通过靶向作用TRAF6,进一步调控失神经肌萎缩;2.阐明miR-125b-5p可以调控TRAF6参与失神经肌萎缩过程;3.探究miR-125b-5p靶向抑制TRAF6对失神经肌萎缩的防治作用及具体分子机制。方法1.通过RT-q PCR检测miR-125b-5p在C2C12肌管萎缩过程中以及失神经肌萎缩过程中的表达变化,分析其与TRAF6表达的相关性。2.构建含有靶基因TRAF6 3’-UTR野生型及TRAF6 3’-UTR突变型的双荧光素酶报告基因系统;将二者与miR-125b-5p模拟物(mimic)或negative control分别共转染HEK293细胞,检测荧光素酶活性。3.分别用miR-125b-5p mimic和miR-125b-5p inhibitor处理营养剥夺诱导的肌管,通过免疫荧光染色分析各组肌管形态变化;通过Western blot检测泛素化蛋白酶水解系统相关蛋白以及自噬-溶酶体水解系统相关蛋白的表达变化。4.制备坐骨神经离断模型,手术当天分别向实验组以及对照组大鼠中注射NC、miR-125b-5p激动剂(agomir)、miR-125b-5p抑制剂(antagomir)、miR-125b-5p agomir+TRAF6过表达病毒,14天后取各组胫前肌,称重分析胫前肌的湿重比;通过免疫荧光染色分析胫前肌肌纤维截面积的变化;通过透射电子显微镜观察分析胫前肌超微结构的变化;通过Western blot检测泛素化蛋白酶体水解系统相关蛋白以及自噬-溶酶体水解系统相关蛋白的表达。结果1.miR-125b-5p在肌管萎缩以及失神经肌萎缩过程中表达下调,且和TRAF6的表达呈相反趋势。2.荧光素酶报告基因系统分析发现,miR-125b-5p可以显著抑制含有野生型TRAF6 3’-UTR质粒的荧光素酶活性,但对含有突变型TRAF6 3’-UTR质粒的荧光素酶活性没有影响。3.体外诱导C2C12萎缩模型,与阴性对照组相比,miR-125b-5p mimic组肌管直径增加,TRAF6表达下调,泛素化蛋白酶体水解系统相关蛋白表达下调,自噬-溶酶体水解系统相关蛋白表达下调;miR-125b-5p inhibitor组肌管直径减小,TRAF6表达上调,泛素化蛋白酶体水解系统相关蛋白表达上调,自噬-溶酶体水解系统相关蛋白表达上调;与miR-125b-5p mimic组相比,miR-125b-5p mimic+TRAF6过表达组肌管直径减小,TRAF6表达上调,泛素化蛋白酶体水解系统相关蛋白表达上调,自噬-溶酶体水解系统相关蛋白表达上调。4.在体胫前肌萎缩模型中,与阴性对照组相比,miR-125b-5p agomir注射组肌纤维截面积明显增加,肌纤维线粒体空泡状态得到缓解,肌小节长度增加;miR-125b-5p antagomir组肌纤维截面积明显减小,线粒体具有更为严重的空泡结构,肌丝肌节不规整,肌小节长度更加减小;与miR-125b-5p agomir注射组相比,miR-125b-5p agomir+TRAF6过表达组肌纤维截面积减小,且自噬情况更加严重。5.与对照组相比,miR-125b-5p agomir组TRAF6表达下调,泛素化蛋白酶体水解系统相关蛋白表达下调,自噬-溶酶体水解系统相关蛋白表达下调;miR-125b-5p antagomir组TRAF6表达上调,泛素蛋白酶体水解系统相关蛋白表达上调,自噬-溶酶体水解系统相关蛋白表达上调;与miR-125b-5p agomir组相比,miR-125b-5p agomir+TRAF6过表达组TRAF6表达上调,泛素蛋白酶体水解系统相关蛋白表达上调,自噬-溶酶体水解系统相关蛋白表达上调。结论1.miR-125b-5p在C2C12肌管萎缩以及失神经肌萎缩过程中表达下调,与TRAF6的表达模式相反;2.miR-125b-5p与TRAF6的3’UTR之间存在相互作用关系;3.miR-125b-5p可以通过靶向TRAF6缓解营养剥夺诱导的肌管萎缩以及失神经引起的肌萎缩,并且减少泛素蛋白酶体系统相关蛋白以及自噬溶酶体系统相关蛋白的表达。