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目的 细胞分裂周期蛋白14B(cell division cycle 14B,CDC14B)是CDC14磷酸酶家族成员之一,在真核细胞中广泛表达,是一类高度保守的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶,其可使靶蛋白的苏氨酸和丝氨酸去磷酸化,进而调节靶蛋白的生物学活性。研究表明,CDC14B广泛参与有丝分裂、减数分裂、胞质分裂、G2期损伤检查点激活、中心体复制、维持纺锤体稳定性、DNA损伤修复、癌变、纤毛形成等生理、病理过程。因CDC14B具有多种生物学功能,成为当前研究热点。而另一重要的细胞周期蛋白Cyclin B1,是细胞周期依赖激酶CDC2的调节亚基,与CDC2的结合形成CDC2/Cyclin B1复合物,即细胞分裂促进因子(mitosis-promoting factor,MPF),促进G2/M期的转变。研究表明,CDC14B在细胞分裂中是一种负性调节因子,因其在不同的亚细胞中有不同的表达与定位,通过其表达及定位调控细胞周期进程。过表达的CDC14B可阻滞鼠植入前胚胎的有丝分裂和合子基因组的激活,而缺失CDC14B会产生异常的纺锤体和胞质分裂的缺陷,表明CDC14B在细胞分裂进程中是必需的。在人骨肉瘤细胞系U2OS的研究中表明:CDC14B在间期定位在细胞核中,在后期聚集到纺锤体中央区,具有捆绑、稳定微管的功能,进而调节细胞的有丝分裂进程。而在小鼠卵母细胞中,CDC14B在MIMII期定位在纺锤体,通过调节E-钙黏蛋白1(cadherin,CDH1),降解细胞周期素B1(Cyclin B1,CCNB1),减少CCNB1与细胞周期依赖性激酶CDK1的结合,对抗CDC2活性,抑制MPF(CDC2/Cyclin B1)的活性,阻止减数分裂(MI-MII期)的恢复。但关于小鼠一细胞期受精卵中是否存在CDC14B这一磷酸酶及它在有丝裂分裂中的调控功能尚不清楚,它是否也定位到纺锤体,通过降解Cyclin B1,抑制MPF活性,从而阻止小鼠受精卵G2/M期的转变。到目前为止,国内外未见报道,本课题主要研究CDC14B在小鼠一细胞期受精卵的G1,S,G2,M期的表达和定位及细胞周期素Cyclin B1的表达情况,为CDC14B在小鼠受精卵G2/M期转换中作用机理的研究提供理论依据。方法 1.通过小鼠超排卵技术分别收集G1、S、G2、M四个时期的一细胞期受精卵。2.通过Real-time PCR检测小鼠一细胞期受精卵各期CDC14B mRNA及Cyclin B1mRNA的相对表达量。3.通过Western blotting检测小鼠一细胞期受精卵各期CDC14B蛋白的表达。4.通过细胞免疫荧光法观察CDC14B和微管蛋白β-tubulin在小鼠一细胞期受精卵G1、S、G2、M各期的共定位情况。结果 1.Real-time PCR显示:CDC14B mRNA在小鼠一细胞期受精卵四个时期的相对表达量不同,在G1至S期逐渐增高,于G2期达高峰,M期又降低。Cyclin B1 mRNA在G1期的表达较S期增高,G2期表达最高,G2期与M期的表达无明显差异。2.Western blotting显示:CDC14B蛋白在小鼠一细胞期受精卵G1、S、G2、M四个时期均有表达,G1至G2期表达逐渐增加,于G2期表达最高,M期表达又降低。3.细胞免疫荧光实验显示:CDC14B在小鼠一细胞期受精卵四个时期的亚细胞定位得CDC14B(红色荧光)和β-tubulin(绿色荧光)在G1期、S期共定位于小鼠受精卵皮质;在早G2期,CDC14B(红色荧光)和β-tubulin(绿色荧光)共定位于皮质和细胞质;在晚G2期,部分CDC14B入核;在M期,CDC14B(红色荧光)和β-tubulin(绿色荧光)共定位到纺锤体。结论 1.在小鼠一细胞期受精卵四个时相中,均有CDC14B蛋白的表达,在G1、S期表达较低,G2期表达最高,M期表达有所降低。2.Cyclin B1的mRNA在G1、S期表达相对较低,在G2、M期表达明显增高,而且在G2与M期的表达无明显差异,由此可知,在小鼠一细胞期受精卵中,CDC14B不是通过降解Cyclin B1的途径来调节G2/M期转换的。3.CDC14B在有丝分裂间期定位于小鼠受精卵皮质和细胞质,在分裂期定位于纺锤体,可能具有调控纺锤体的功能。