【背景】近年来，全球T2DM的发病率急剧增加，T2DM已成为严重威胁人类健康的重要公共卫生问题。尽管学术界与管理机构对T2DM的流行状况已有充分了解，对其发病的危险因素如遗传易感性、肥胖、少动、精神压力等认识也逐渐清晰，T2DM的临床治疗效果也取得显著进展，然而问题是，T2DM的流行仍然呈现恶性激增的态势，由“治”前移到“防”的研究还处于探索阶段并且进展缓慢。问题的关键在于T2DM的致因、信号调控特别是围绕糖脂代谢异常、IR的发生机制还有许多“瓶颈”没有突破。我们的前期基因筛查结果显示，在易于发生氧化应激诱导IR的个体中，转录因子Nrf2和TCF2的表达均显著下调。进一步的研究表明，作为核转录因子既受上游信号分子的调控，激活后的Nrf2和TCF2又能调控一系列影响IR的分子，两种转录因子在T2DM的发病中可能发挥关键的调控作用。那么，上调Nrf2和TCF2是否能够降低血糖、改善IR和保护β细胞功能？Nrf2和TCF2是否存在相互调控作用？能否发现更新、更有效的以Nrf2和TCF2为靶点的候选药物？这些都是研究T2DM发病机制和治疗策略亟待解决的重大科学问题，对于阐明Nrf2和TCF2分子在T2DM发生中的关键作用、发现新的候选药物、控制T2DM暴发流行，具有非常重大的意义。【目的】(1)研究转录因子Nrf2调控的氧化还原平衡失调在高血糖氧化损伤、IR和β细胞损伤中的作用机制。(2)阐明Nrf2-抗氧化酶链在降血糖、改善IR和β细胞损伤中的作用及OA的调控机制。(3)探讨胰岛素对Nrf2-氧化还原平衡的调控作用。(4)研究转录因子TCF2的功能及在IR和β细胞损伤中的作用与RA的调控机制。(5)探讨转录因子Nrf2和TCF2的相互调控作用及在T2DM发病中的作用机制。【方法】（1）Nrf2-抗氧化酶链在高糖氧化损伤中的调控机制。高水平葡萄糖和RSG培养肝细胞，观察高糖对细胞的毒性作用和RSG对细胞的保护作用及机制。使用MTT测定细胞活力，使用DCFH-DA荧光探针测定细胞ROS生成，利用Western blot和免疫荧光测定相关蛋白表达。（2）Nrf2-抗氧化酶链在ROS诱导IR中的调控机制。在传统高脂饮食诱导IR动物模型的基础上，使用高脂高糖饮食合并注射氧化剂（tBHP）诱导IR动物模型；并使用葡萄糖氧化酶，通过尾静脉注射，创建快速构建IR动物模型的方法。测定空腹血糖、腹腔注射葡萄糖耐量和胰岛素耐量，测定血清FFAs含量。透射电镜观察肝组织结构变化。RT-PCR测定相关因子mRNA表达。测定Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性以及线粒体呼吸链酶复合物活性。Western blot测定相关蛋白表达和胰岛素信号传导。（3）Nrf2-抗氧化酶链在ROS诱导β细胞损伤中的调控机制。免疫组化和免疫荧光观察转录因子Nrf2在大鼠胰岛中的分布以及在INS-1β细胞中的亚细胞分布。FFAs处理INS-1细胞，MTT测定细胞活力，Hoechst测定细胞凋亡，DCFH-DA测定ROS生成，Western blot测定Nrf2和抗氧化酶的表达，ELISA测定GSIS，RT-PCR测定相关因子mRNA表达。合成针对Nrf2的siRNA和过表达Nrf2的腺病毒，观察Nrf2对细胞活力和FFAs细胞毒性的影响。观察短期和长期HF饮食对Nrf2和胰岛素分泌的影响。使用各种抑制剂，明确FFAs影响Nrf2表达的信号通路。观察INS-1细胞GSIS过程中，ROS生成和Nrf2表达变化。（4）胰岛素对Nrf2-氧化还原平衡的调节作用及机制。100nM胰岛素培养BRL-3A肝细胞不同时间点，观察胰岛素在体外对Nrf2氧化还原平衡的影响。大鼠、小鼠腹腔注射10IU/kg胰岛素，取不同时间点肝组织，观察胰岛素在体内对Nrf2氧化还原平衡的影响。使用DCFH-DA荧光探针，观察100nM胰岛素培养BRL-3A肝细胞1.5h时间内ROS生成动态变化。Western blot测定转录因子Nrf2和各种抗氧化酶的表达以及胰岛素下游信号通路。使用抑制剂，验证胰岛素调控Nrf2-氧化还原平衡的信号途径。（5）OA通过激活Nrf2-抗氧化酶链对IR和β细胞损伤的修复机制。db/db糖尿病小鼠腹腔注射OA，持续2周。测定FBG、IPGTT、IPITT。测定动物体重，观察内脏脂肪含量、照相。取肝组织，测定肝细胞胰岛素信号。制作胰腺组织冰冻切片，TUNEL法测定组织胰岛细胞凋亡。使用FFAs和OA培养INS-1细胞，测定细胞活力和GSIS。Annexin Ⅴ-FITC/PI双染检测INS-1细胞凋亡。Western blot检测Nrf2、抗氧化酶表达和相关激酶磷酸化。使用siNrf2观察Nrf2在OA保护β细胞中的作用。使用Akt、ERK和PPARγ抑制剂，研究OA调控Nrf2的信号通路。（6）转录因子TCF2的关键作用与RA的调控机制。免疫荧光观察TCF2在BRL-3A细胞中的亚细胞定位。分离大鼠胰腺，免疫组化和免疫荧光观察TCF2在胰岛中的分布。INS-1细胞免疫荧光观察TCF2在β细胞中的亚细胞定位。BRL-3A细胞分别进行siTCF2干涉和TCF2慢病毒过表达处理，测定胰岛素信号。大鼠尾静脉注射TCF2慢病毒，测定FBG，进行IPGTT和IPITT实验，测定肝组织胰岛素信号。TCF2慢病毒联合GOX处理大鼠，测定FBG，进行IPGTT和IPITT实验，测定肝组织胰岛素信号。INS-1细胞分别进行siTCF2干涉和TCF2慢病毒过表达处理，测定GSIS。RA处理BRL-3A细胞，测定TCF2表达和胰岛素信号。RA单独或与FFAs处理INS-1细胞，测定TCF2和胰岛素分泌相关因子表达，检测GSIS。（7）Nrf2-TCF2相互作用及OA-RA联合干预机制。BRL-3A分别转染过表达Nrf2腺病毒和过表达TCF2慢病毒，Western blot测定Nrf2、TCF2、抗氧化酶和糖代谢相关因子的表达。使用DHE荧光探针测定BRL-3A细胞和TCF2-BRL-3A细胞的ROS含量，激光共聚焦显微镜和流式细胞仪进行测定。不同浓度GOX分别处理BRL-3A细胞和TCF2-BRL-3A细胞，MTT测定细胞活力，镜下观察细胞形态。GOX处理BRL-3A细胞不同时间点，Western blot测定Nrf2和TCF2的表达。STZ诱导大鼠发生高血糖，腹腔注射OA、RA和OA+RA半剂量联合给药，观察FBG变化，Western blot测定胰腺Nrf2和TCF2的表达。不同浓度STZ处理INS-1细胞，测定ROS含量和GSIS。TCF2-INS-1细胞转染过表达Nrf2腺病毒，观察STZ对GSIS影响的变化。【结果】（1）高水平葡萄糖使肝细胞活力显著降低，产生明显的细胞毒性。随着葡萄糖浓度增加，ROS生成逐渐增加。低浓度葡萄糖促进转录因子Nrf2表达。在高糖作用下，Nrf2和一系列抗氧化酶的表达明显降低。此外，高糖还导致PPARγ表达降低、COX-2表达降低，促进PKC磷酸化，减弱Akt和ERK磷酸化。RSG可以显著抑制高糖的细胞毒性，抑制ROS生成，并上调PPARγ和Nrf2。PPARγ抑制剂显著抑制RSG对Nrf2、COX-2表达和Akt、ERK磷酸化的影响，而对PKC磷酸化无显著影响。（2）氧化剂tBHP加剧HF饮食诱导的血脂紊乱，加重HF饮食诱导的动物胰岛素敏感性降低和糖耐量受损，促进HF饮食诱导的胰岛素信号紊乱，诱导线粒体损伤和内质网应激，加剧HF饮食诱导的Nrf2-抗氧化酶链紊乱。GOX诱导大鼠糖耐量和胰岛素耐量受损，诱导大鼠胰岛素信号紊乱，影响JNK、ERK、p38的磷酸化，诱导内质网应激和线粒体功能障碍，诱导氧化应激和抑制Nrf2-抗氧化酶链。抗氧化剂NAC抑制GOX诱导的IR。（3）生理状态下，胰岛存在少量Nrf2表达，Nrf2主要位于胰岛β细胞的细胞质中。脂毒性可以明显诱导β细胞凋亡、胰岛素合成分泌相关因子表达降低和胰岛素分泌功能的降低。低剂量的FFAs促进Nrf2和各种抗氧化酶的表达，使细胞活力增强。高剂量的FFAs抑制Nrf2和各种抗氧化酶的表达，使细胞活力降低。siNrf2明显抑制低剂量FFAs诱导的各种抗氧化酶的表达和细胞活力的增强，并显著降低GSIS。过表达Nrf2的腺病毒可以显著抑制高剂量FFAs诱导的GSIS和细胞活力的降低。短期高脂饮食促进动物胰岛素分泌和胰腺Nrf2表达，长期高脂饮食抑制动物胰岛素分泌和胰腺Nrf2表达。FFAs促进线粒体和NADPH氧化酶生成ROS。低剂量的FFAs促进Akt和ERK磷酸化。抑制ROS生成和Akt、ERK磷酸化，可以显著抑制低剂量FFAs诱导的Nrf2表达。INS-1β细胞GSIS过程偶联Nrf2表达的一过性升高。（4）胰岛素处理细胞和动物不同时间点，转录因子Nrf2和各种抗氧化酶表达的变化趋势主要表现为先升高后降低到基础水平。Nrf2核转位也表现为先升高后降低。使用siNrf2可以显著抑制胰岛素诱导的各种抗氧化酶的表达。胰岛素作用下，细胞内ROS含量显著升高，最高点出现在胰岛素作用后30min左右。抗氧化剂、DPI和3NP可以显著抑制胰岛素促进ROS的生成。胰岛素作用下，Akt和ERK磷酸化变化趋势与Nrf2表达变化趋势相似，抑制Akt和ERK的磷酸化，胰岛素刺激的Nrf2表达被显著抑制。胰岛素预处理保护细胞抵御tBHP诱导的细胞活力的降低和细胞凋亡，干涉Nrf2后，胰岛素的保护作用明显减弱。（5）OA对db/db糖尿病小鼠具有明显的降血糖、改善IR和保护β细胞作用。OA使db/db糖尿病小鼠体重增加明显减慢、内脏脂肪减少，促进鼠脂肪分解。在db/db糖尿病小鼠中，OA通过激活Nrf2-抗氧化酶链抑制db/db小鼠胰岛细胞凋亡。OA抑制FFAs诱导的INS-1细胞活力、GSIS的降低和细胞凋亡。干涉Nrf2后，OA对INS-1细胞脂毒性的保护作用明显减弱。抑制Akt、ERK和PPARγ后，OA对Nrf2的激活明显减弱。（6）正常条件下，BRL-3A细胞中，TCF2在细胞质和细胞核中都有表达，主要位于细胞质中。干涉TCF2后，BRL-3A细胞的胰岛素信号明显减弱。稳定表达TCF2的TCF2-BRL-3A细胞中，GLUT2和GCK表达显著增强，PEPCK表达显著降低，胰岛素信号显著增强。注射TCF2慢病毒的大鼠，胰岛素敏感性显著增强，并对GOX诱导的IR产生明显抵抗。在大鼠胰腺组织中，TCF2主要位于分泌胰岛素的胰岛β细胞中。在INS-1细胞中，细胞质和细胞核都有TCF2表达，TCF2主要位于细胞质。干涉TCF2后，INS-1细胞的GSIS明显减弱。稳定表达TCF2的TCF2-INS-1细胞中，GLUT2和GCK表达显著增强，PDX-1表达显著降低，GSIS也显著降低。RA处理BRL-3A细胞后，TCF2表达剂量依赖性增加，胰岛素信号显著增强，并可以明显地抑制GOX诱导的胰岛素信号的紊乱。RA处理INS-1细胞后，TCF2表达显著增强，GSIS明显增强，伴随着GLUT2、GCK和PDX-1表达的显著增强。RA可以显著抑制FFAs引起的脂毒性。（7）与BRL-3A细胞相比，过表达Nrf2后，各种抗氧化酶表达显著增加，而对TCF2和PPARγ表达无显著影响。过表达TCF2后，抗氧化酶SOD1的表达显著降低，而GCLm和GPx1的表达显著增加。此外，过表达TCF2使PPARγ的表达显著增加。过表达TCF2未对Nrf2和其它抗氧化酶的表达产生直接的影响。过表达TCF2后，ROS含量显著增加。GOX作用下，BRL-3A细胞中Nrf2和TCF2的表达都表现为先升高后降低。TCF2-BRL-3A细胞对GOX毒性的抵抗明显增强。OA和RA单独应用都可以在一定程度上使STZ诱导的糖尿病大鼠血糖降低，OA和RA半剂量联合应用降血糖效果更为明显。STZ处理，使INS-1细胞活力和GSIS明显降低。与INS-1细胞相比，过表达TCF2的TCF2-INS-1细胞对STZ毒性的抵抗明显增强。TCF2-INS-1细胞转染过表达Nrf2的腺病毒，可进一步增强细胞抵抗STZ的能力。【结论】（1）在肝细胞中，葡萄糖可以激活PKC促进ROS的生成，低水平葡萄糖生成低水平的ROS，激活Nrf2和下游抗氧化酶，发挥抗氧化防御作用；高水平的葡萄糖生成高水平的ROS，下调Nrf2和下游抗氧化酶，诱导氧化应激损伤。Nrf2调控的抗氧化酶在机体内构成了一个潜在的“抗氧化酶链”，以此抵御氧化应激损伤。一旦ROS生成过量，Nrf2调控的抗氧化酶链受到损伤，导致氧化应激损伤持续加重。Nrf2-抗氧化酶链损伤是高糖诱导氧化应激损伤的关键。RSG一方面通过不依赖于PPARγ的途径抑制PKC而阻断ROS生成，另一方面通过PPARγ依赖性途径激活Nrf2和下游抗氧化酶促进ROS的清除。（2）氧化剂tBHP通过诱导氧化应激，加剧HF饮食诱导的IR。无论在体内还是在体外，GOX可以通过生成ROS，下调Nrf2调控的抗氧化酶链，影响多种相关因素，包括PPARγ降低、MAPKs磷酸化改变、内质网应激和线粒体损伤等，最终导致胰岛素信号紊乱、糖耐量和胰岛素耐量异常，出现FBG升高。尽管还需要进一步的实验明确相关分子机制，现在有的实验证据表明，ROS的生成是IR发生的根本诱因，Nrf2-抗氧化酶链在IR中发挥着关键性的防御作用。本实验创建了一种利用GOX快速构建IR动物模型的方法，并为ROS在IR发生中的关键作用以及通过Nrf2-抗氧化酶链对IR进行预防和治疗提供新的思路。（3）ROS在β细胞维持正常功能和功能障碍中发挥着双刃剑的作用。FFAs长期暴露通过促进ROS生成，影响β细胞葡萄糖感受能力和胰岛素分泌功能。FFAs产生的一定剂量的ROS和伴随GSIS过程生成的ROS可以通过ERK和Akt信号激活Nrf2-抗氧化酶链。Nrf2的这种激活作用反映了机体增强抗氧化防御系统抵御氧化应激损伤的适应性保护能力。本实验发现Nrf2-抗氧化酶链在决定ROS作用方向和保护β细胞抵御氧化应激损伤中发挥关键性作用。（4）胰岛素可以通过Nrf2诱导一系列抗氧化酶的表达。胰岛素诱导的这些抗氧化酶的有序激活在体内形成了一个隐形的“抗氧化酶链”，组成了一个牢固的抗氧化防御系统。线粒体和NADPH氧化酶生成的ROS激活ERK-Akt信号通路在胰岛素调控Nrf2中发挥关键作用。胰岛素通过ROS-ERK-Akt-Nrf2信号级联对氧化还原平衡的调节作用，使我们重新认识胰岛素作用的本质。（5）氧化应激在β细胞脂毒性中发挥重要作用。OA可以显著降低ROS生成，抑制PA对Nrf2和相关抗氧化酶的下调（HO-1、SOD2、GCLc、GCLm和GPx1等）。此外，OA还明显地促进Nrf2核转位，干涉Nrf2以后，OA的保护作用明显减弱，说明Nrf2-抗氧化酶链的激活在OA的保护作用中扮演着关键的角色。信号通路的研究发现，OA使ERK和Akt的磷酸化显著增强，使PPARγ表达明显增加。抑制剂U0126、LY294002和GW9662可以显著减弱OA的保护作用，说明ERK/Akt/PPARγ信号通路参与了OA对胰岛β细胞的保护作用。OA可以通过ERK/Akt/PPARγ信号通路，激活Nrf2抗氧化系统，当Nrf2被OA激活时，可以诱导一系列抗氧化酶的表达，这些抗氧化酶组成一个隐形的“抗氧化酶链”，巩固细胞的抗氧化防御系统。总之，OA在降血糖、改善IR和保护β细胞功能中都发挥重要的角色，这其中，Nrf2-抗氧化酶链的激活在其中发挥着关键的作用（6）TCF2在正常条件下以无活性的形式存在于细胞质中，在刺激因素作用下，TCF2在某种机制的作用下，被转移入核内发挥作用。在肝细胞中，TCF2促进胰岛素信号传导，调控糖代谢，促进糖原合成、糖酵解，抑制糖异生。在胰岛β细胞中，TCF2同时正向、负向调控胰岛素的合成和分泌，TCF2的稳态对于β细胞的正常功能至关重要。可见，转录因子TCF2在胰岛素信号、糖代谢和β细胞功能中都具有重要的作用，深入研究TCF2的调控机制对于T2DM的机制研究和治疗都具有重要的意义。（7）转录因子Nrf2一方面作为氧化还原系统的核心转录因子，另一方面又可以调控脂代谢；转录因子TCF2是调节糖代谢的重要转录因子，同时又可以一方面通过特定抗氧化酶交叉调控氧化还原系统，另一方面通过PPARγ间接影响Nrf2。同时，Nrf2通过调节ROS水平，影响TCF2的功能。以ROS为中心，Nrf2和TCF2存在着密切而复杂的相互调控关系，而这些相互作用的稳态对机体维持正常功能、抵御氧化应激损伤和T2DM发生发挥至关重要的作用。