拟穴青蟹是一种重要的海水经济养殖动物。近些年来，随着养殖密度的提高以及海水养殖环境的污染加剧，导致养殖青蟹的病害时有发生，其原因除常见的病原微生物感染外，环境胁迫因素的影响也是不容忽视的原因之一。传统观念上，对于病原微生物引起的养殖业损失非常重视，但大多数忽略了或者没意识到环境胁迫因素对青蟹养殖业的影响。迄今，有关环境胁迫引起拟穴青蟹体内应激反应的机制与效应研究很少，因此本项研究在前期探索的基础上，拟深入开展病原因子和环境应激因子对拟穴青蟹免疫系统的影响及其相互关系，为较全面的了解养殖青蟹的发病原因以及制定更有效的防病措施提供科学依据。本文在所建立的拟穴青蟹血细胞SSH差减文库基础上，克隆获得了丝氨酸蛋白酶同系物SPHL和热休克蛋白Sp-Hsp10编码序列，阐明了SPHL和Sp-Hsp10的分子特征、基础性表达特性及部分生理功能和转录调控机制，并深入研究了两种蛋白在病原感染与环境因素胁迫状态下的适应性表达模式。主要结果如下:　　1、拟穴青蟹丝氨酸蛋白酶同系物SPHL的分子特征　　本文获得拟穴青蟹SPHL全长cDNA序列，该1325bp长度序列包括861bp的ORF(包括终止密码子TAA)、39 bp的5非翻译区和425 bp的3非翻译区三部分。由SPHL ORF推导的氨基酸序列包含预测的N端信号肽和C端Tryp-SPc结构域，信号肽切割位点位于Ala20和Gln21之间，Tryp-SPc结构域包含活性位点和底物结合位点，SPHL的丝氨酸结构域活性位点突变了两个氨基酸，其活性位点由Tyr77，Asp132和Glu235三个残基组成。　　2、拟穴青蟹丝氨酸蛋白酶同系物SPHL在正常生长和细菌感染下的表达模式　　SPHL可以在正常拟穴青蟹多个组织（器官）中表达，在血细胞和鳃中表达量相对较高，其次分别为眼柄、心脏、肝胰腺、胃和神经。拟穴青蟹不同发育阶段样品中，包括胚胎期（embryoⅠ;embryoⅡ; embryoⅢ和embryoⅤ）、潘状幼体Ⅰ期、潘状幼体Ⅲ期、大眼幼体和仔蟹（血细胞），SPHL基因均有表达，其中胚胎（Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ）期、仔蟹和成年蟹血细胞样品表达量较高，在胚胎Ⅱ期和大眼幼体中表达量较低。　　通过荧光定量的方法以检测SPHL在拟穴青蟹免疫应激过程中的表达模式，本文主要检测了鳃、肝胰腺和血细胞中SPHL的时效性转录水平。在鳃中，SPHL在攻毒后6h表达水平差异显著(p＜0.05)，并且到细菌感染后24 h都维持较高的表达量;细菌感染后3h，肝胰腺中SPHL转录水平就被诱导表达，6h与对照组相比差异显著(p＜0.05);血细胞中SPHL在细菌感染后3h表达水平差异显著(p＜0.05)，6h表达水平最高，与对照组比较，提高将近30倍，并且12 h仍然维持高水平表达，与对照组比，差异显著(p＜0.05)。　　3、拟穴青蟹丝氨酸蛋白酶同系物SPHL原核表达及其表达产物的活性鉴定　　利用基因工程技术，构建了SPHL基因的原核表达载体，获得了高效表达的重组SPHL蛋白(rSPHL)，通过测定rSPHL对血细胞溶解上清液（Hemocyte LysateSupernatant，HLS）中PO活性的影响，评价了rSPHL潜在的生物学功能，结果显示rSPHL实验组的PO活性远高于HLS单组分实验组和其它对照组，差异显著(p＜0.05)，说明rSPHL具有一定的体外生物活性，并可能在HLS的proPO酶级联反应过程中起作用。　　4、拟穴青蟹热休克蛋白10分子特征　　本文通过RACE-PCR基因克隆手段获得了Sp-Hsp10 cDNA全长序列，该序列包含93 bp5-UTR、345 bp3-UTR和306 bp的ORF框，该ORF框编码一条含102个氨基酸残基多肽序列，分子量约为11 kDa，pI值为6.73。通过反向PCR技术扩增获得Sp-Hsp10基因组序列，Sp-Hsp10基因组由三个外显子和两个GT-AG内含子相间组成。　　5、拟穴青蟹热休克蛋白105-侧翼基因组调控序列的扩增和启动子分析　　根据大部分物种Hsp10和Hsp60基因组呈现“头并头”的结构特点，通过扩增拟穴青蟹热休克蛋白60(Sp-Hsp60)编码序列和基因组序列，获得完整的拟穴青蟹热休克蛋白10(Sp-Hsp10)5-侧翼基因组调控序列和拟穴青蟹Sp-Hsp10中间区域序列Sp-Hsp60基因组组成结构。在包含Sp-Hsp105-侧翼基因组调控序列的中间区域序列中，含有SP1、NKx-2、HLF、AML-1a（runt-factor alpha1）位点和热休克转录因子的结合位点(HSE)。其中HSE以共有序列5-NGAANNTTCN-3或5-NTTCNNGAAN-3形式单独存在。　　通过构建启动子效率重组报告载体和检测转染细胞荧光素酶活性，发现Sp-Hsp10转录起始位点前的5-侧翼基因组调控序列均具有一定的启动子活性。　　6、拟穴青蟹热休克蛋白10基础性表达模式和细胞定位　　Sp-Hsp10 mRNA在正常拟穴青蟹各组织（器官）中的表达模式，结果显示Sp-Hsp10 mRNA在所检测的8个器官中为组成型表达，其中血细胞中表达量较高，在肌肉组织和其它实质性器官如肝胰腺、胃中表达量也较高，在眼柄中表达量较低。利用制备的Sp-Hsp10多克隆抗体进行免疫印迹检测，发现Sp-Hsp10存在于线粒体，说明其可能在一个相对封闭的细胞器中行使重要的生物学功能。　　7、拟穴青蟹热休克蛋白10在环境因素应激下的适应性表达模式　　体外培养的拟穴青蟹血细胞经37℃热应激后1h，血细胞Sp-Hsp10呈现适应性诱导表达，表达量差异极显著(p＜0.01)。热应激恢复过程中2h、4h、6h、8h采集样品与对照组相比，Sp-Hsp10表达量维持较高水平，差异极显著(p＜0.01)。终浓度为200μmol和400μmol的H2O2氧化应激下，血细胞Sp-Hsp10适应性上调表达，与对照比差异极显著(p＜0.01)。终浓度为1μmol Cd2+下，Sp-Hsp10基因表达量比未处理组高出3倍，差异极显著(p＜0.01);浓度为5μmolCd2+时，Sp-Hsp10基因也有适应性上调表达，差异显著，但是诱导表达量比1μmol Cd2+浓度组低。结果表明，Sp-Hsp10的转录表达水平受环境应激因子的影响。