【摘 要】
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目的：阐明半胱天冬酶募集结构域3（CARD3）对小鼠炎症性肠病的影响及其作用,并探讨其可能的分子机制。方法：第一部分：采用WT和CARD3 KO小鼠,建立炎症性肠病模型,行表型相关分析,明确CARD3基因在炎症性肠病中的重要作用。选用6-8周,雄性,体重20-24 g,WT和CARD3 KO小鼠,各随机分成普通饮水组（normal drink, ND）和葡聚糖硫酸钠饮水组（DSS组,即将葡聚糖硫酸
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目的：阐明半胱天冬酶募集结构域3（CARD3）对小鼠炎症性肠病的影响及其作用,并探讨其可能的分子机制。方法：第一部分：采用WT和CARD3 KO小鼠,建立炎症性肠病模型,行表型相关分析,明确CARD3基因在炎症性肠病中的重要作用。选用6-8周,雄性,体重20-24 g,WT和CARD3 KO小鼠,各随机分成普通饮水组（normal drink, ND）和葡聚糖硫酸钠饮水组（DSS组,即将葡聚糖硫酸钠在常温下溶于小鼠饮水中,浓度为3%）饲养7天。实验中每天详细记录小鼠饮水量,体重,粪便性状和隐血实验（OB）结果。在实验第7天,小鼠用乙醚吸入麻醉,经眶静脉采血分离血清后,颈部脱臼法处死小鼠,取小鼠整个结肠部分（从回盲部至直肠）拍照并记录其总长度,其中一部分置于4%的多聚甲醛中用于病理实验,另一部分置于-80℃冰箱中保存。采用HE染色法对小鼠结肠病理进行评分,采用免疫荧光法检测炎性细胞（包括中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞）在小鼠结肠中的表达,采用RT-PCR法检测小鼠结肠黏膜中炎性细胞因子的表达(包括IL-6,IL-17A,IFN-γ, TNF-α和TGF（3）。第二部分：在葡聚糖硫酸钠造模的最后一天,小鼠口服一定量的FITC-dextran,4小时后,小鼠用乙醚吸入麻醉,经眶静脉采血分离血清后,颈部脱臼法处死小鼠,检测血清中FITC的浓度,荧光显微镜检测小鼠结肠黏膜FITC的分布和计数。采用RT-PCR和Western Blot法检测结肠黏膜中紧密连接蛋白（TJ蛋白,包括occludin和claudin 2）的表达。为了确定肠道渗透性的改变是否与结肠黏膜的凋亡有关,我们采用Western Blot法检测肠道黏膜中凋亡蛋白（Bax, Bcl2, Bad和Bcl-xl）的表达,同时采用TUNNEL法检测肠道黏膜中凋亡情况。整个肠道组织的凋亡检测并不能说明凋亡就一定来源于肠上皮细胞,于是我们原代培养了WT和CARD3小鼠肠上皮细胞,采用流式细胞仪检测了DSS诱导后肠上皮细胞的凋亡情况。第三部分：为了确定CARD3基因在炎症性肠病患者中表达,我们收集了炎症性肠病患者的肠道组织15例,并收集了体检人员正常肠道组织20例作对照,采用免疫荧光技术检测CARD3在炎症性肠病患者中的表达,并分析了CARD3基因的表达与炎症性肠病患者的疾病活动度之间的关系。结果：第一部分：①在WT和CARD3 KO小鼠炎症性肠病模型中,我们观察到正常饮水情况下,WT和CARD3 KO小鼠结肠长度、疾病活动度评分和结肠病理评分无明显差异（P>0.05）,但在DSS造模后,CARD3 KO小鼠结肠长度改变,疾病活动度评分和结肠病理评分均显著低于WT组小鼠（P<0.05）；②同时我们还观察到CARD3 KO小鼠结肠黏膜中炎性细胞的数量显著低于WT小鼠。此外RT-PCR结果显示,CARD3 KO小鼠结肠黏膜中炎性细胞因子mRNA的表达均明显低于WT组小鼠。以上结果显示CARD3 KO小鼠炎症程度较WT小鼠低,提示CARD3基因在炎症性肠病中发挥着重要作用。第二部分：①肠道渗透性实验结果显示,FITC在CARD3 KO和WT组小鼠结肠组织和血清中基础水平没有显著差异,但在CARD3 KO小鼠组血浆中FITC浓度显著低于WT小鼠组,同时CARD3 KO小鼠组FITC渗透入黏膜的深度明显低于WT小鼠组；②RT-PCR结果显示CARD3 KO小鼠组occludin和claudin-2 mRNA的表达显著高于WT小鼠组。以上结果显示CARD3 KO小鼠组肠道渗透性降低的程度显著低于WT小鼠组；③Western Blot结果显示CARD3KO小鼠结肠组织凋亡蛋白表达显著低于WT KO小鼠组；④TUNNEL结果进一步证实CARD3 KO小鼠组结肠组织凋亡明显低于WT KO小鼠组；⑤流式细胞技术结果显示,原代培养的WT和CARD3 KO小鼠结肠上皮细胞中,前者凋亡率显著高于后者。第三部分：①CARD3在炎症性肠病患者中的表达显著高于正常对照者；②CARD3在炎症性肠病中的表达与疾病活动度呈正相关。结论：CARD3通过增加肠道上皮细胞的凋亡,参与调控小鼠结肠上皮的渗透性,进而影响炎症性肠病的发生发展过程。
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