【摘 要】
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目的MAGE-C2基因是一种原癌基因,属于肿瘤睾丸抗原(cancer-testis antigen,CTA)MAGE家族中的一员。MAGE-C2在人体除睾丸组织外的正常组织中不表达,而在多种恶性肿瘤组织中包括肺癌组织中表达,其表达与肿瘤的发生发展密切相关。为研究MAGE-C2作为靶蛋白在淋巴瘤治疗中的作用,并作为建立针对MAGE-C2抗原的CAR-T细胞研究项目的起始部分,本项工作首先对人T细胞淋
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目的MAGE-C2基因是一种原癌基因,属于肿瘤睾丸抗原(cancer-testis antigen,CTA)MAGE家族中的一员。MAGE-C2在人体除睾丸组织外的正常组织中不表达,而在多种恶性肿瘤组织中包括肺癌组织中表达,其表达与肿瘤的发生发展密切相关。为研究MAGE-C2作为靶蛋白在淋巴瘤治疗中的作用,并作为建立针对MAGE-C2抗原的CAR-T细胞研究项目的起始部分,本项工作首先对人T细胞淋巴瘤细胞系Jurkart的MAGE-C2基因用CRISPR/CAS9RNP基因编辑技术进行了敲除,并研究MAGE-C2基因敲除对诱导凋亡、抑制增殖和增强化疗药物甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)作用的影响。方法1.构建表达CAS9基因的PMJ915-CAS9(69090)质粒,使其在大肠杆菌BL21(DE3)扩增并表达,收获纯化CAS9蛋白。2.设计并合成敲除MAGE-C2基因的CRISPR系统中适配的g RNA。3.用电转法转入Jurkart细胞CAS9蛋白/MAGE-C2特异g RNA复合物,敲除MAGE-C2基因。4.观察MAGE-C2基因敲除后,Jurkart细胞自发凋亡,增殖率变化和对化疗药物作用的影响。结果成功构建了表达CAS9的载体并纯化其表达的CAS9蛋白,与MAGE-C2特异g RNA形成复合物转染48小时后,经定量RT-PCR和Western blot检测,成功敲除MAGE-C2基因。细胞出现自发性凋亡、增殖率显著降低(P<0.05)。药物甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)处理敲除MAGE-C2基因的细胞48小时后,相比于未敲除细胞,有显著增强的杀伤作用(P<0.05)。结论MAGE-C2基因在维持淋巴瘤细胞的稳定增殖中起重要作用,用CRISPR/CAS9基因编辑技术可以成功敲除其表达,并诱发淋巴瘤细胞凋亡和化疗药杀伤作用的增强。此研究为针对抑制MAGE-C2基因的疗法的创新奠定了基础,并为用CRISPR/CAS9基因编辑技术建立识别MAGE-C2的CAR-T开启了初步技术方法。
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