论文部分内容阅读
研究背景:在中国,传统中医药参与了肝癌防治的全过程并且发挥了积极的作用。辨证论治是传统中医学的重要特征,也是中医药诊治疾病的关键部分。临床工作及研究发现,湿热证是原发性肝癌患者常见证型之一,此证肝癌患者在临床特征方面也多与其他证型的肝癌患者不同,因此本课题在第一部分对肝癌湿热证患者与非湿热证患者的临床特征进行了对比。研究表明,中医证候与肠道微生物具有相关性,不同证候的肠道微生态具有其特异性。口腔及胃肠道是人体消化道的两大组成部分,口腔微生物系统也是人体第二大微生物系统,仅次于肠道微生物系统,且两者具有同源性。因此,本课题在第二部分一方面尝试探索肝癌湿热证候与舌苔微生物的相关性,另一方面也试图从舌苔微生物角度探索肝癌研究的方向。研究目的:1、阐述肝癌湿热证患者和非湿热证患者临床特征的差异。2、探究肝癌湿热证与舌苔微生物的相关性,以期为肝癌湿热证提供微生物学的依据。3、探索肝癌患者舌苔微生物的特异性,试图为肝癌的研究提供新的方向。研究方法:1、随机选取年龄≥18岁且临床诊断是原发性肝癌的患者,在一名中医副主任医师的指导下结合患者的实际情况填写《中医肝病证候调查表》（见附表1）,采用对比《原发性肝癌常见中医基本证候定性诊断规范》（见附表2）的方法,先确定肝癌湿热证患者55例,再选取肝癌非湿热证患者52例,并且收集了两组患者的临床数据用统计学方法对比分析。2、从肝癌湿热证组及肝癌非湿热证组各随机抽取30例,再从体检人群中收集25例做为健康对照组。因此,本部分有两大组,分别肝癌组和健康对照组,细分为肝癌湿热证组、肝癌非湿热证组及健康对照组。提取全部舌苔标本中的所有DNA,使其16s rDNA的V2-V4高变区得以扩增,使用高通量测序技术对三组舌苔中的16s rRNA基因进行测序分析。在QIIME软件上操作,让每个OTU都与SILVA数据库完成比对从而获得分类学依据。最后,对各组间物种的多样性、物种的组成及丰度、重要物种、差异物种和物种的功能预测做了分析比较。结果:1、本课题分析了55个肝癌湿热证患者和52个肝癌非湿热证患者的临床差异,发现两组间在总胆红素（TB）、直接胆红素（DB）、白细胞（WBC）、中性粒细胞（NEUT）、中性粒细胞百分比（NEUT%）及身体质量指数（BMI）方面均有差异,且差异具有统计学意义（P<0.05）。2、在Sobs指数下三组间及两组间均具有差异,但是差异不具有统计学意义。在门水平上,在两组间,相对丰度在厚壁菌门（Firmicutes）、梭杆菌门（Fusobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、SR1Absconditabacteria、螺旋菌门（Spirochaetae）及绿弯菌门（Chioroflexi）存在差异,差异具有统计学意义（P<0.05）。在三组间,相对丰度在梭杆菌门（Fusobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）及互养菌门（Synergistetes）存在差异,差异具有统计学意义（P<0.05）。在属水平上进行组间差异显著性分析,在两组间,相对丰度在梭杆菌属（Fusobacterium）、二氧化碳噬细胞菌属（Capnocytophaga）、韦荣球菌属（Veillonella）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）及放线菌属（Actinomyces）存在差异,差异具有统计学意义（P<0.05）,其中健康对照组中梭杆菌属（Fusobacterium）、二氧化碳噬细胞菌属（Capnocytophaga）和卟啉单胞菌属（Porphyromonas）明显高于肝癌组;肝癌组中韦荣球菌属（Veillonella）和放线菌属（Actinomyces）相对丰度明显高于健康对照组。在三组间,相对丰度在梭杆菌属（Fusobacterium）、韦荣球菌属（Veillonella）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、放线菌属（Actinomyces）、二氧化碳噬细胞菌属（Capnocytophaga）及普雷沃菌属-7（Prevotella7）存在显著的统计学差异,差异具有统计学意义（P<0.05）。其中,健康对照组中梭杆菌属（Fusobacterium）、二氧化碳噬细胞菌属（Capnocytophaga）和卟啉单胞菌属（Porphyromonas）相对丰度明显高于肝癌湿热证组和肝癌非湿热证组,肝癌湿热证组中韦荣球菌属（Veillonella）、放线菌属（Actinomyces）及普雷沃菌属-7（Prevotella7）相对丰度明显高于健康对照组和肝癌非湿热证组。通过LEfSe多级物种差异判别分析,我们发现肝癌组样本中厚壁菌门（Firmicutes）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、韦荣球菌科（Veillonellaceae）、韦荣球菌属（Veillonella）等对差异效果影响较大,而肝癌湿热证组韦荣球菌科（Veillonellaceae）和普雷沃菌属-7（Prevotella7）等对差异效果影响较大。我们利用16s高通量测序对舌苔微生物组进行功能预测,显示结果发现,健康对照组富集的功能主要包括复制、重组与修复等,而肝癌组该功能偏低。肝癌组主要富集的是磷酸戊糖途径及赖氨酸生物合成。通过对肝癌湿热证组富集的微生物分析发现该组主要功能可能是增加诱导更多炎症因子发生炎症反应的风险等。结论:1、肝癌湿热证患者和非湿热证患者在临床特征上具有差异性。2、肝癌湿热证患者舌苔有其独特的微生物结构,可以为肝癌湿热证微生物的研究提供思考。3、和健康对照组相比,肝癌患者的舌苔微生物有其特异性。