近年来，RNA沉默已经引起人们广泛的关注，成为分子生物学的研究热点之一。 病毒或转座子入侵，以及植物体内或转基因产生的RNA发夹结构等都可能成为诱导RNA沉默的因素。为了认识正向重复的DNA结构转基因后诱发植物基因沉默的情况，为深入了解植物基因沉默机制提供更多的参考资料，本论文就正向重复序列本身的沉默及正向重复序列3’端相连基因引起内源基因沉默情况，进行了以下研究。 ①cat正向重复序列在转基因玉米中引起高水平的转基因沉默构建了4个表达载体：phC3G、phC4、phCAT和phGUS，其中phC4由四个正向的报告基因cat首尾相连融合而成；phC3G由三个正向重复的cat基因末尾连一个正向的报告基因gus融合而成；而phCAT和phGUS则分别由单个的cat和gus基因构成作为对照。四个载体皆使用潮霉素作为筛选标记，由35S启动子启动。通过基因枪法将四个载体分别转入玉米胚性愈伤中。PCR、Southern杂交检测证明外源基因已经转入到玉米中。RT-PCR检测表明：转phC4和phC3G玉米的CAT转录量极低或根本检测不到，而phCAT转基因玉米则能检测到明显的CAT转录本。 CAT-ELISA检测得知：转phC3G载体的玉米cat沉默效率达到90％，而转phC4载体的玉米cat沉默效率达到100％，并且在沉默植株中检测到了约25nt的siRNA，说明这种沉默属转录后沉默，即RNA沉默。 ②正向重复序列引起3’端相连基因及其同源基因的沉默首先检测在瞬时表达体系中这种沉默向3’端gus延伸的情况。将单个gus基因通过基因枪轰击胚性愈伤确证瞬时表达体系工作良好。之后将C3G质粒轰击愈伤，72小时后进行GUS染色，无蓝斑产生。再用将C3G质粒基因枪轰击已稳定表达gus的T1代玉米胚性愈伤，GUS染色同样无蓝斑产生。推测由于C3G载体中GUS基因的沉默生成的siRNA与已转入的稳定表达的gus基因识别后，引起原稳定表达的gus也发生了沉默。 构建了3个植物表达载体：phIJse、phIJan和phIJ，其中phIJse由四个正向重复的cat末尾连一个正向的lojap基因(简称ij，玉米内源基因，其突变后，玉米叶片等部位出现白色的条斑)构成；phIJan由四个正向重复的cat末尾连一个反向的ij基因构成；而phIJ载体只由一个单个的ij基因构成，做对照使用。三个载体皆使用潮霉素作为筛选标记，由35S启动子启动，由基因枪法分别转入玉米中。转phIJse与phIJan载体的玉米叶片皆有条斑出现，phIJse载体转基因玉米出现条斑的比例为10％，而phIJan载体为22％。phIJse与phIJan转基因玉米皆有高水平的cat基因沉默。phIJ载体转基因玉米没有表型变化。分子检测证明外源基因已转入玉米中。定量PCR分析表明与未转基因相比出现条斑表型的玉米中ij基因转录量明显降低，Northern杂交未检测到ij转录本。另外，检测到与RNA沉默相关的25nt的siRNA。 根据以上结果我们认为正向重复序列转基因后可能直接以其自身为模板合成双链RNA，接下来被降解，而siRNA浓度在沉默内源基因效率方面起到很大作用，据此，我们提出了一种正向重复序列引起基因沉默机制的模式。本研究所用载体系统phC3G、phIJse、phIJan有望用于大规模玉米功能基因的研究。 在抗青链酶菌中，TyrA和ORF438基因对于黑色素的合成是必需的。为了研究这两个基因在棉花中的表达能否改变棉花纤维的颜色，我们根据棉花纤维对密码子的偏好性改造了这两个基因，改造后的基因分别命名为atyrA和dORF438。在这两个基因的末端分别加上液泡定位信号后，在棉花纤维特异的Ltp3启动子启动下，atyrA和dORF438首先被转入到模式植物烟草中。分子检测表明dtyrA和dORF438基因已成功地在烟草中表达，并且在转基因烟草的表皮毛中观察到黑色素的积累。当通过花粉管通道法把这两个基因转入到棉花中后，棉纤维的颜色从白色变成了棕色。分子检测证明这两个基因已转入到棉花中且成功表达。以上结果表明人工改造后合成的dtyrA和dORF438基因能在烟草和棉花中正常工作。我们的研究为棉纤维颜色改良的研究提供了一种参考方法。