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背景:胃肠间质瘤(gastrointestinal stromal tumors,GISTs)是消化道最常见的间叶源性肿瘤,多数胃肠间质瘤发病的关键因素为获得性突变的PDGFRA和KIT酪氨酸激酶异常活化。虽然酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate)作为治疗转移复发及不可切除胃肠间质瘤标准一线治疗的靶向药物取得了良好的临床效果,但临床工作者在临床实践发现仍有部分病人对伊马替尼耐药,其中有原发性耐药及继发性耐药,导致治疗这些胃肠间质瘤患者变得非常棘手。研究发现,DOG1特异性表达于胃肠间质瘤,敏感性极高,作为诊断GIST而与其他的肉瘤相鉴别的标志物,可能参与胃肠间质瘤的发生发展。目的:沉默GIST-T1细胞株DOG1后观察细胞株的增殖是否受到抑制;初步探索钙激活氯通道DOG1与胃肠间质瘤(GISTs)增殖凋亡之间的关系,寻找胃肠间质瘤新的治疗靶点,为治疗胃肠间质瘤伊马替尼原发性耐药及继发性耐药患者提供联合治疗的理论依据。方法:利用RNA干扰技术沉默GIST-T1细胞株DOG1基因,采用RT-q PCR筛选最佳干扰质粒;采用CCK法检测GIST-T1细胞株DOG1沉默前后细胞株的增殖情况;CCK法检测DOG1沉默后是否影响imatinib的药物敏感性;流式细胞术检测经imatinib处理后各组细胞的凋亡情况及观察DOG1干扰前后GIST-T1细胞株的细胞周期分布情况;利用Western blotting蛋白半定量方法测定DOG1干扰前后DOG1、KIT及KIT相关通路蛋白的表达情况;利用graph prism软件对实验数据进行分析,研究分析DOG1沉默前后G1IST-T细胞株的增殖情况及DOG1沉默前后KIT通路蛋白的表达情况。结果:1、DOG1m RNA的RT-q PCR扩增结果示:sh RNA-1、sh RNA-2、sh RNA-3、sh RNA-4质粒干扰GIST-T1细胞株后,DOG1m RNA的表达量分别为对照组的0.7999倍、0.3814倍、0.8526倍、0.9669倍。2、干扰0min、60min时干扰组GIST-T1细胞与未干扰组GIST-T1细胞相比,两组之间的OD值无显著差异(P>0.05);但在干扰120min、240min时两组之间OD值差异明显(P<0.05)。4.imatinib毒性试验表明其在GIST-T1细胞株的IC50在10-2-10-1mg/ml。5、与单纯DOG1m RNA干扰细胞组比较,DOG1m RNA干扰组细胞株经0.01ug/ml、0.1ug/ml、1ug/ml不同浓度的imatinib处理后,OD值未见明显不同差异(P>0.05);而DOG1m RNA干扰组的细胞经10ug/ml、100ug/ml浓度的imatinib处理后,两组的OD值有显著差异(P<0.001)。6、0.01ug/ml、0.1ug/ml、1ug/ml三个不同浓度imatinib处理GIST-T1细胞株及DOG1m RNA干扰的GIST-T1细胞后两组细胞的OD值有显著差异(P<0.01);而10ug/ml、100ug/ml高浓度的imatinib处理干扰前后两组细胞株,这两组之间的OD值无显著差异(P>0.05)。7、流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况:对照组细胞经100ug/ml药物imatinib处理后D4期即早期凋亡的细胞百分比由4.5%增加到23.0%;阴性对照组细胞经100ug/ml药物imatinib处理后D4期细胞百分比由4.8%增加到19.6%;SH-2组细胞经100ug/ml药物imatinib处理后D4期细胞由4.3%增加到12.3%。8、流式细胞术检测各组细胞的细胞周期分布情况:对照组中G1期细胞占57.1%,S期细胞占42.9%;阴性对照组中G1期细胞占57.5%,S期细胞占41.3%;SH-2组的G1期细胞占61.7%,S期细胞占37.8%。9、SH-2组及SH-2(+)组DOG1蛋白的表达量较C组的表达量明显减少,有统计学意义(P<0.05),而C(+)组DOG1的表达与C组相比较差异不显著,无统计学意义(P>0.05);SH-2组p-KIT的表达较C组并无明显变化,无统计学意义(P>0.05),但是C(+)组的p-KIT表达量较C组明显降低,有统计学意义(P<0.05);C(+)组、SH-2组、SH-2(+)组的AKT、p-AKT表达量与C组相比差异不显著,无统计学意义(P>0.05),C(+)组、SH-2组、SH-2(+)组p-ERK1/2的表达量与C组相比,p-ERK1/2下降明显,有统计学意义(P<0.05)。结论:1、DOG1m RNA最佳的干扰质粒对为sh RNA-2,其干扰序列(5’-3’)为:CCTCACGGGCTTTGAAGAG。2、体外实验表明:GIST-T1细胞株的DOG1m RNA沉默成功后,可抑制GIST-T1细胞的增殖,说明DOG1参与调节GISTs的增殖;流式细胞术初步实验结果表明,下调DOG1可将细胞周期阻滞于G1/G0期,DOG1可能通过调节细胞周期G1/S期来调节细胞增殖。3、GIST-T1细胞DOG1基因沉默与否并不影响imatinib的药物敏感性,与imatinib并不具有双重抑制GIST-T1细胞增殖的能力。4、沉默GIST-T1细胞株DOG1m RNA前后p-KITY703以及KIT下游信号通路蛋白的表达量无明显改变;但是下调DOG1后p-ERK1/2的表达量显著减少,说明了DOG1通过ERK1/2信号通路而不是通过KIT信号通路来调节细胞增殖。