论文部分内容阅读
第一部分2-乙酰胺基芴/部分肝切除模型中activinA通路变化的研究目的研究2-乙酰胺基芴/部分肝切除模型中activinA通路的变化,以及与卵圆细胞增殖的关系。方法建立2-乙酰胺基芴/部分肝切除卵圆细胞增殖模型,肝切除后不同时间点处死大鼠,取肝组织。荧光定量PCR检测不同时间点肝组织中activinA, activinA抑制物卵泡抑素、activinAⅠ型受体(AVR1)、activinAⅡ型受体(AVR2)的表达变化,免疫组织化学检测Pan-CK阳性卵圆细胞的增殖情况以及activinA f(?)卵泡抑素的表达。结果在2-乙酰胺基芴/部分肝切除模型中,肝切除后肝切除后9d卵圆细胞数量到达顶峰,肝切除后第12天卵圆细胞数量开始下降,逐步减少甚至消失。肝切除后,直至肝切除第9d-12dactivinA的表达量迅速上升并在肝切除后第12d上升至顶峰,肝切除15d后activinA的表达逐渐下降直至正常水平。在未肝切除的正常对照大鼠肝组织中卵泡抑素的表达非常低,而在肝切除后第二天,卵泡抑素表明显增加,主要表达于汇管区的肝细胞细胞浆,肝切除后第4d,卵泡抑素表达量下降至正常值。肝切除后早期(0-9d)AVR1mRNA的表达没有显著性差异,直至9d以后AVR1mRNA表达水平快速升高,至12d AVR1mRNA表达达到高峰,并维持至15d,随后表达量明显下降,至肝切除后21d AVR1mRNA表达水平将至正常范围。AVR2mRNA在肝切除后表达随即下调,在肝切除后1d下降至对照水平以下,随后AVR2 mRNA的表达逐渐上升并在肝切除后15d到达顶峰,随后逐步下降,至肝切除后21d恢复至对照组水平。结论在肝切除后卵圆细胞增殖的早期,由于卵泡抑素的高表达和activinA及其受体的低表达,残肝中activinA通路活性较低；在卵圆细胞增殖的终止阶段,activinA通路的活性增高。提示activinA可能是卵圆细胞增殖的负调控因子。第二部分activinA通过smad通路抑制卵圆细胞增殖目的体外研究activinA对卵圆细胞系LE6增殖的调控作用并探讨可能的机制。方法首先用不同浓度梯度的activinA处理LE6细胞,采用CCK-8, Brdu incorporation检测,annexinV/PI流式细胞术检测LE6细胞增殖、凋亡的变化;然后使用200ng/ml activinA处理LE6细胞,使用western-blot检测LE6细胞中细胞周期相关蛋白的变化和ERK、JNK、P38 MAPK通路的激活,western-blot、co-IP检测smad通路的激活;使用shRNA沉默LE6细胞中的smad4,观察阻断smad通路后LE6细胞对activinA的反应；使用卵泡抑素阻断activinA与其受体的结合,观察LE6细胞增殖的变化。结果ActivinA可以抑制LE6细胞的增殖,但并不诱导明显的凋亡。ActivinA可以下调LE6细胞中cyclinE及cyclinD1的表达,并上调p15和p21的表达,降低Rb磷酸化;activinA可以激活smad通路,但对MAPK通路没有显著影响；卵泡抑素或沉默smad4可以阻断activinA对卵圆细胞增殖的抑制作用,并阻断activinA对下游基因的调控作用。结论ActivinA可以通过激活smad通路下调cyclinE及cyclinD1的表达,并上调p15和p21的表达,抑制cylinD-CDK4/6复合物和cyclinE-CDK2复合物的形成,下调其活性,从而降低Rb磷酸化,阻止E2F的释放,使细胞周期阻滞于G1期,抑制细胞的增殖。第三部分门静脉注射卵泡抑素可以促进卵圆细胞介导的肝脏再生目的体内研究门静脉注射卵泡抑素对2-乙酰胺基芴／部分肝切除模型中卵圆细胞增殖的作用。方法动物分为卵泡抑素组和对照NS组。卵泡抑素组在部分肝切除后经门静脉给予1mg卵泡抑素,对照组给予等体积的生理盐水。肝切除后不同时间点处死大鼠,切取残肝组织,免疫组织化学检测Pan-CK (?)日性卵圆细胞数量和Brdu阳性细胞数量,计算肝脏／体重比评估肝脏再生情况。结果肝切除后第4天-12天,卵泡抑素组大鼠肝组织中Brdu (?)日性细胞数明显高于对照NS组；肝切除后6-15天卵泡抑素组Pan-CK阳性卵圆细胞数明显高于对照组；肝切除后第9-15天卵泡抑素组肝脏／体重比明显高于对照NS组。结论门静脉注射卵泡抑素可以阻断肝脏中activinA通路的活性,促进卵圆细胞介导的肝脏再生。进一步证明activinA是一个重要的卵圆细胞增殖负调控因子。