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共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid，CLA）是具有共轭双键的十八碳二烯酸的统称，由于其多样的生理活性而受到广泛关注。为了满足CLA在医药及营养领域的应用需求，通过生物技术生产单一、安全的CLA活性异构单体成为CLA合成技术的发展趋势。本论文将来源于痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）的亚油酸异构酶（PAI）基因分别在大肠杆菌（Escherichia coli）、高山被孢霉（Mortierella alpina）和耶氏解脂酵母（Yarrowia lipolytica）中进行异源表达，确定耶氏解脂酵母作为合适的trans-10，cis-12-CLA生物合成系统，在此基础上，通过基因工程手段构建了一株trans-10，cis-12-CLA的高产菌株，并对发酵条件进行初步优化，进一步提高CLA产量。论文的主要研究结果如下：(1)构建了三种重组大肠杆菌重组菌株，分别表达三种重组PAI：C端融合6×His-tag的PAI、N端融合6×His-tag的PAI和不带有6×His-tag的PAI。将经镍柱纯化后的PAI免疫兔子，得到PAI多克隆抗体。通过SDS-PAGE和western blot分析三种重组菌的蛋白质表达情况，并利用气相色谱检测胞内相对酶活。结果显示，在相同的培养及诱导表达条件下，三种重组大肠杆菌均成功表达了具有亚油酸异构酶活性的重组PAI，6×His-tag的融合表达对于重组菌株的生长及PAI的表达总量没有影响，但减少了PAI可溶性表达量，并且降低酶活，而C端添加亲和标签比N端对此影响更为显著。为了获得更多的活性PAI，在产油真菌中异源表达PAI基因时，应不添加任何亲和纯化标签。(2)对M. alpina ATCC32222的孢子产量、孢子萌发率、孢子收集方法和孢子对抗生素敏感性进行了研究，确定最佳产孢培养条件是28℃、 PDA斜面上静置培养30天；为了去除菌丝并减少孢子的损失，采用60目滤布和20μm滤膜结合的两步法过滤孢子液；选择潮霉素作为筛选标记，潮霉素的最佳使用浓度为0.8-1.5mg/mL。构建了两种带有PAI基因的重组质粒：pD4-pai和pBIG-pai，分别用于基因枪轰击和农杆菌介导两种转化法。对转化实验条件进行摸索，最终通过农杆菌介导转化法获得稳定的转化子。以转化子的基因组DNA和cDNA为模板，通过PCR扩增证实了PAI基因成功整合在M.alpina转化子基因组上并发生转录，同时证明M. alpina表达系统构建成功。但M. alpina重组菌未能成功表达亚油酸异构酶。来源于细菌的PAI基因和真核生物M. alpina在密码子使用偏好性方面的差异可能是导致PAI异源表达失败的重要原因。(3)鉴于PAI基因在M. alpina中异源表达失败，首先根据Y. lipolytica的密码子偏好性，优化了PAI基因，并在PAI基因的起始密码子前加上了Kozak序列。天然的PAI基因（pai）和优化后的基因（opai）分别以单拷贝整合方式整合到Y. lipolytica基因组上。通过对重组蛋白表达量分析及产物trans-10，cis-12-CLA含量测定，发现在七个整合了pai的重组Y. lipolytica菌株中，只在两个转化子中检测到了PAI蛋白，而十二个带有opai的重组菌株中全部检测到了PAI。脂肪酸分析的结果与蛋白表达结果一致，带有天然PAI基因的转化子只有两个检测到产物trans-10，cis-12-CLA。经过密码子优化后，trans-10，cis-12-CLA平均产量提高了10倍，为2.1mg/L。这些结果证明PAI基因的优化是在真核生物中成功实现异源表达的前提。通过多拷贝整合方式，进一步提高了PAI表达量和trans-10，cis-12CLA含量，其平均含量为14.3mg/L，是opai的单拷贝重组菌中CLA平均产量的6.8倍。(4)从增加底物LA和提高PAI表达量两方面对酵母菌株进行改造。以带有单拷贝opai的Y. lipolytica重组菌株为出发菌株，将来源于M. alpina的delta-12脱氢酶基因在Y. lipolytica中进行异源表达，胞内亚油酸（LA）含量从总脂的27.8%提高至62.2%，底物的增加使得产物trans-10，cis-12CLA含量从2.3mg/mL升至3.8mg/L；在opai的原启动子hp4d上游插入12个UAS1B调控元件，得到新启动子hp16d，opai在新启动子调控下，PAI表达量提高了3倍，trans-10，cis-12CLA产量也提高至7.0mg/L；将以上两个基因改造策略结合使用后，二者的效果得到了叠加，trans-10，cis-12CLA产量提高了4.8倍，至11.0mg/L；最后通过多拷贝整合方式，进一步增强了二者的作用，trans-10，cis-12CLA产量为36.8mg/L，是出发菌株的16倍。经过分子改造后的最优菌株Polh-pINA1292-spopai-d12-16中CLA产量为44.9mg/L，占总脂肪酸的9.8%。(5)基于对重组蛋白和脂质底物的双重需求以及Y.lipolytica高效吸收利用脂类物质的特性，采用添加了2%亚油酸的培养基YNBDL6，定向增加PAI底物。在摇瓶培养的72h，trans-10，cis-12CLA产量达到最高，而且在培养基上清中检测到产物CLA，胞内含量为0.2g/L，培养基上清中为0.1g/L，总产量是YPD培养基中CLA产量的6.7倍。通过提高培养基中氮含量，抑制了Y.lipolytica产酸，提高了菌体生长速度、脂质吸收效率及PAI表达量，在高氮培养基YN20BDL6中培养72h，trans-10，cis-12CLA的产量达到2.6g/L，为低氮培养基中CLA产量的8.7倍。在高氮培养基配方的基础上，考察不同纯度的LA对Y.lipolytica重组菌产CLA的影响。结果显示，LA纯度的提高对于Y.lipolytica重组菌株的生长和产脂没有影响，而且trans-10，cis-12CLA的产量随着LA纯度的增加而提高，添加了纯度为33%、65%、96%LA的培养基中Polh-pINA1292-spopai-d12-16的CLA总产量分别为0.9g/L、2.6g/L和3.7g/L。大豆油价格低廉，来源广泛，其中LA的含量占总脂肪酸的56%，用大豆油替代培养基中的亚油酸，Y.lipolytica重组菌的生长、产脂及CLA产量与添加65%LA的结果相近，trans-10，cis-12CLA的最高产量同样出现在摇瓶发酵的72h，总产量为2.5g/L，证明Y.lipolytica重组菌能够高效转化大豆油为CLA。在5-L发酵罐中，Polh-pINA1292-spopai-d12-16利用添加大豆油的培养基，在发酵38.5h，CLA产量达最高，胞内为3.1g/L，培养基中为0.9g/L。经过培养条件的初步优化，CLA的总产量达到4g/L，为YPD培养基中CLA产量的90倍，是迄今为止报道的最高水平的20倍。通过胞外酶活检测及显微镜观察细胞完整性，结果显示胞外并未检测到PAI酶活，也并未观测到细胞碎片，说明培养基上清中的产物CLA不是由PAI分泌或细胞裂解引起，推测其原因是胞内外发生脂质交换。