论文部分内容阅读
母畜子宫为支持妊娠进行,会发生一系列生理变化,妊娠结束后子宫会恢复至妊娠前状态,功能也逐渐恢复,这一生理过程为子宫复旧。子宫复旧过程涉及到解剖学,组织学和细胞学的变化,是进行下一次妊娠的关键。奶牛产后子宫内膜炎可导致子宫复旧延迟,从而导致繁殖性能下降。临床上采用的抗生素等治疗方法对于子宫内膜炎导致的子宫复旧不全治疗效果并不理想。中药益母草被广泛应用于妇产科疾病的治疗,益母草碱是益母草主要的活性成分,有研究发现益母草碱具有抗凋亡作用,而细胞凋亡与子宫复旧的关键环节之一即子宫内膜修复紧密相关,PI3K/Akt信号通路通过各种反应对细胞凋亡进行调控,与细胞凋亡密切相关。因此本试验通过对产后小鼠灌服益母草碱来研究子宫复旧的作用机制。本研究首先对产后小鼠子宫灌注5 mg/mL脂多糖(LPS)20μL确定小鼠子宫复旧不全模型建立时间;然后分别给予不同浓度的益母草碱(0.5 mg/kg、1.5 mg/kg、4.5 mg/kg)处理1天或3天,比较益母草碱灌服组与正常子宫复旧组以及子宫复旧不全模型组的小鼠体内生殖激素的变化规律,同时检测益母草碱对细胞凋亡及PI3K/Akt信号通路中凋亡相关因子的m RNA和蛋白表达的变化规律,来探讨益母草碱(Leo)对产后子宫复旧不全的影响以及细胞凋亡相关基因及蛋白的表达情况的影响,为益母草碱治疗母畜产后子宫复旧不全提供新的思路和理论支持。主要研究内容和结果如下:1.小鼠子宫复旧不全模型建立时间选择将36只已分娩雌鼠随机分成2组,模型组(LPS组)和正常组(生理盐水对照组),每组18只,子宫分别灌注LPS(5 mg/mL)20μL或生理盐水20μL,生产当天记作第0 d,第1 d进行灌注,每组雌鼠麻醉后处死取样时间分为LPS/生理盐水灌注后12 h(1 d)、3 d、5 d,每次每组处死小鼠6只。病理学观察发现,1 d、3 d LPS组与1 d、3 d对照组相比,LPS组出现子宫内膜连续性中断,伴有充血、出血和广泛的炎性细胞浸润。5 d LPS组内膜完整,与5d对照组子宫复旧情况相近。凋亡相关基因Bax实时荧光定量PCR结果发现,1 d组LPS处理后,Bax表达极显著上升(P<0.01),3 d组LPS处理后Bax表达显著上升(P<0.05),5 d组LPS处理后无显著变化。据组织病理学观察及凋亡相关基因Bax表达情况分析,选取LPS处理1 d、3 d进行子宫复旧不全模型的建立,进行后续试验。2.益母草碱对产后小鼠复旧不全子宫组织的影响将60只产后雌鼠随机分为2个大组:益母草碱处理1 d组和益母草碱处理3 d组,每个大组30只,每个大组均做五种处理,每种处理6只,(1)空白组子宫灌注生理盐水20μL+生理盐水灌胃,(2)LPS组子宫灌注LPS(5 mg/mL)20μL+生理盐水灌胃,(3)益母草碱低剂量组子宫灌注LPS(5 mg/mL)20μL+益母草碱(0.5mg/kg)灌胃,(4)益母草碱中剂量组子宫灌注LPS(5 mg/mL)20μL+益母草碱(1.5mg/kg)灌胃,(5)益母草碱高剂量组子宫灌注LPS(5 mg/mL)20μL+益母草碱(4.5mg/kg)灌胃。生产当天记作第0 d,益母草碱1 d组:第1 d子宫灌注LPS,12 h后益母草碱灌胃;益母草碱3 d组:第1 d子宫灌注LPS,12 h后益母草碱灌胃,第2d、3 d益母草碱分别再灌胃1次,最后一次灌胃处理后的第二天麻醉后处死小鼠,采集血液和子宫组织。对小鼠及子宫进行质量等基础数据测量,以及对子宫组织进行HE染色观察。结果发现,益母草碱处理1 d组内,与LPS组相比,Leo(1.5 mg/kg)、Leo(4.5mg/kg)处理后子宫湿重指数极显著或显著减少(P<0.01或P<0.05);与LPS组相比,Leo(0.5 mg/kg、1.5 mg/kg、4.5 mg/kg)处理后子宫单侧子宫体宽度极显著或显著减少(P<0.01或P<0.05)。HE染色发现灌注LPS后子宫组织出现内膜更新延迟,充血、出血等现象,导致一定程度的子宫复旧不全,益母草碱处理后能够促进内膜更新,组织充血、出血现象减轻,炎性细胞浸润减少,且呈剂量依赖性。3.益母草碱对产后小鼠雌激素和孕酮浓度的影响对上述小鼠采血,分离上清,ELISA法检测。结果发现,益母草碱对雌二醇(E2)浓度无显著影响;益母草碱3 d组组内,与对照组相比,LPS组以及Leo(0.5 mg/kg)组孕酮浓度显著升高(P<0.05),与Leo(0.5 mg/kg)组相比,Leo(4.5 mg/kg)组孕酮浓度显著降低(P<0.05)。4.益母草碱对PI3K/AKT通路相关基因表达的影响采0用Real-time PCR法检测PI3K/Akt信号通路中细胞凋亡相关基因的表达。结果发现,益母草碱1 d组,与对照组相比,LPS处理后PI3K基因表达显著升高(P<0.05),Leo(4.5 mg/kg)处理后较LPS组PI3K极显著降低(P<0.01),较Leo(0.5mg/kg)组,PI3K呈显著降低趋势(P<0.05)。益母草碱处理1 d组和3 d组中,与LPS组相比,Leo(4.5 mg/kg)组Akt基因表达极显著降低(P<0.001),与Leo(0.5 mg/kg)组相比,Leo(4.5 mg/kg)组Akt基因表达极显著或显著降低(P<0.01或P<0.05);与对照组相比,LPS处理后Bax极显著或显著升高(P<0.001或P<0.05),与LPS组相比,Leo(1.5 mg/kg)处理后Bax表达极显著或显著降低(P<0.001或P<0.05),Leo(4.5 mg/kg)处理后Bax表达极显著降低(P<0.001或P<0.01);Leo(4.5 mg/kg)处理后较LPS组Bcl-2显著升高(P<0.05)。免疫组织化学染色法及免疫印迹法检测凋亡相关蛋白的表达。结果发现,凋亡相关蛋白Bax在LPS组子宫黏膜层与浆膜层为强表达,益母草碱处理后仅黏膜层有表达,且表达减弱,益母草碱处理1 d和3 d组Bax蛋白表达情况,与对照组相比,LPS处理后Bax蛋白表达极显著上升(P<0.01),与LPS组相比,Leo(1.5 mg/kg)、Leo(4.5 mg/kg)组Bax表达均极显著或显著降低(P<0.001或P<0.01或P<0.05)。综上所述,益母草碱能够改善脂多糖导致的子宫复旧不全,抑制子宫组织细胞细胞凋亡,促进内膜修复,减轻充血、出血,减少炎性细胞浸润,这与益母草碱对PI3K/Akt信号通路的调控有关。研究结果为益母草碱治疗母畜产后子宫复旧不全提供新的思路和理论依据。